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本实验尝试用10-3mg/ml大肠杆菌细胞壁的脂多糖组分、色氨酸、热灭活的酵母菌和热灭活的小麦赤霉病菌等四种诱导源诱导粉纹夜蛾、白纹伊蚊、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、菜青虫、小菜蛾等六种离体培养的昆虫细胞,发现诱导后在细胞的上清中产生了抗菌活性物质。诱导细胞的上清液经三氯乙酸沉淀提取诱导蛋白,采用琼脂糖孔穴扩散法和比浊法测定了这些细胞的诱导上清对多种细菌和真菌的抗菌活性。比较了不同诱导时间和诱导浓度对产生抗菌活性物质的影响。结果如下:
(1)实验证明,LPS是一种较为有效的诱导源,可诱导多种细胞产生抗菌活性物质。
(2)使用LPS诱导细胞,5B1、C7-10、SF-9、SL四种细胞经诱导后均能产生抗菌活性物质,Px和Pr-49两种细胞的诱导上清则未检测到抗菌活性。其中5B1细胞经诱导后产生的抗菌活性物质的活力最强。
(3)对5B1、C7-10、SF-9、SL细胞测定诱导物浓度与细胞上清液抗菌肽活力的关系,结果发现不同浓度的LPS诱导细胞产生的抗菌肽活性不同,不同细胞的最佳诱导浓度也不完全一致。其中5B1、SF-9、SL细胞的最佳诱导浓度是10-3mg/ml,C7-10细胞的最佳诱导浓度是10-4mg/ml;当诱导浓度达到1mg/ml时,细胞会出现破裂死亡。
(4)选取5B1、C7-10、SF-9三种细胞测定诱导时间与细胞产生的抗菌活性物质的活力关系,研究发现诱导时间不同,细胞上清液的抗菌活性不同。诱导4-8h后细胞上清液开始出现抑菌活性,随着时间延长,抗菌活力逐渐上升,5B1、SF-9细胞均在16h左右达到最大值,C7-10细胞在36h左右达到最大值,再延长时间,抗菌活力逐渐下降,48h后降至较低。
(5)选取了6种动物病原细菌和5种植物病原真菌,测定5B1、C7-10、SF-9三种细胞经LPS诱导后所产生的抗菌活性物质的抗菌谱,发现都具有广谱的抗菌活性,同时也发现不同细胞的诱导上清对不同细菌的抗菌活性存在差异。
(6)用TricineSDS-PAGE分析了5B1细胞诱导样品比对照样品多出1条较为明显的蛋白带,分子量在5.2KD左右;C7-10细胞诱导样品比对照样品多出了2条较为明显的蛋白带,分子量分别在7KD左右和5KD左右。
(7)采用灭活的小麦赤霉病菌和灭活的酿酒酵母诱导5B1细胞后发现,诱导后产生了抗菌活性物质,该物质具有明显的抗大肠杆菌K12D31和抗酿酒酵母的活力。