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随着蛋白组学等生命科学相关领域的快速发展，离心、沉淀、结晶、透析等传统的蛋白质分离方法己不能满足当前研究和应用的需要。对复杂蛋白质样品进行快速、高效、准确的分离分析的需求日益迫切。本论文在大量文献调研的基础上，总结了现代液相色谱技术在蛋白质分离上的应用及最新进展，介绍了双水相技术的应用和进展。目前，蛋白质分离方法主要可分为以萃取纯化为主的上游技术，以及以液相色谱法为主的仪器分离检测技术两类。本论文从这两类技术的发展入手，提出了发展新型液相色谱固定相和新型萃取体系，以用于蛋白质快速、温和、高效分离的这一研究思路。
本论文的主要研究内容和创新之处如下：
首先，采用石英晶体微天平生物传感器筛选小分子配基和蛋白质之间的弱相互作用，首次发展了以多羟基小分子三羟甲基甲胺、丝氨醇、乙醇胺为配基的弱亲和色谱。通过石英晶体微天平传感器筛选出三种小分子配基和细胞色素c及溶菌酶之间的特异性弱相互作用。前沿色谱法测定结果表明，三种配基和两种蛋白复合物的表观解离常数均在104 mol/L数量级，属于弱亲和作用力。在此基础上，利用配基对两种目标蛋白结合力的差异，发展了通过一次洗脱实现两个蛋白的亲和分离的弱亲和色谱方法，突破了传统的“一对一”蛋白质亲和分离的模式。基于三种配基的亲和色谱柱均具有很好的重复性，其中Tris为配基的亲和柱在实验进行的12个月期间内稳定性良好。本工作采用的小分子弱亲和色谱配基具有独特的优势和潜力，而采用石英晶体微天平传感器筛选则是一种快速、准确的获得弱亲和配基的方法。
其次，合成了金纳米粒子修饰的新型高聚物毛细管整体柱。在经巯基修饰的聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）毛细管整体柱孔道表面，发展了在线合成和直接注入两种修饰金纳米粒子的方式。在优化的反应条件下，两种方法均可获得表面被金纳米粒子均匀修饰的高聚物整体柱，其中后者可获得33％的金纳米粒子高覆盖率。在修饰前后整体柱的通透性保持不变，且均优于同样尺寸的填充柱。通过三项“破坏性”实验证明，金纳米粒子修饰的毛细管整体柱具有很好的稳定性，适于用作蛋白质分离的色谱固定相基质。
在此基础上，采用带有所需官能团的巯基化合物对整体柱表面的金纳米粒子进行修饰，获取了具有不同表面官能团及色谱分离性质的毛细管整体柱。同时，通过巯基交换的方式在同一色谱柱上实现了多种可替换的色谱分离模式。将这一“多功能”、“可替换”的新型毛细管色谱柱用于毛细管电色谱分离多肽，以及离子交换和反相色谱法分离蛋白质。基于其良好的通透性和可变的表面性质，实现了对蛋白质等生物大分子的快速、多模式分离。这一方法不仅可作为普适性的整体柱修饰方法，也避免了毛细管色谱柱的从头重复合成，提高了实验效率。
此外，本论文还发展了离子液体双水相体系在蛋白质萃取上的应用。系统考察了最常见的咪唑基离子液体-盐双水相体系的成相性质及其与离子液体结构的关系。以辣根过氧化物酶为模型蛋白，研究了离子液体-盐双水相体系中蛋白质的分配和活性保持情况。离子液体阳离子的离液序列越高越有利于成相，但也同时更易引起蛋白质失活。在离子液体双水相中，较高的水含量大大削弱了离子液体和蛋白质之间的氢键作用力，使得蛋白质的活性得到很好保持。在优化的条件下，80％的辣根过氧化物酶分配在上相，活性得以很好保持，且离子液体双水相比传统高聚物双水相黏度大大降低，有利于操作。该部分工作拓展了新型离子液体双水相体系在蛋白质萃取方面的应用。