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阿霉素(Doxorubicin, Dox)属广谱高效抗肿瘤药,是临床上最为常用的一种蒽醌类抗肿瘤药物,但其心脏毒性严重。目前关于Dox心脏毒性机制的研究主要集中在DNA嵌入损伤、自由基损伤以及线粒体损伤等,其中自由基理论被大多数研究者所接受。Dox对心肌细胞具有独特的亲和力,易在心脏中特异性蓄积,并且在代谢过程中产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS),过量的ROS攻击心肌细胞,引起心肌氧化损伤。研究表明,Dox可增加心肌细胞内ROS的产生和降低心肌细胞内抗氧化物酶的活性,使心肌细胞处于氧化应激状态,从而引起心肌病和充血性心力衰竭。因此,多年来关于有效防治Dox心脏毒性的研究一直备受研究者们的关注。金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类富含半胱氨酸的低分子量的金属结合蛋白,广泛存在于哺乳动物的各种器官组织中。它具有清除自由基的功能,对外源性物质所引起的细胞组织损伤具有一定的保护作用。近年来MT对Dox心脏毒性的保护作用引起了研究者的关注。心脏MT特异性过表达FVB小鼠(MT-TG)和MT基因(MT-Ⅰ/Ⅱ)敲除的C57BL小鼠(MT-/-)这两种MT转基因动物模型,对阐明MT生物学功能起到了十分重要的作用。与正常小鼠相比,心脏过度表达MT的转基因(MT-TG)小鼠可显著降低Dox急性及慢性引起的心脏毒性。与之相反,在MT-/-小鼠上Dox所引起心脏损伤程度比MT+/+小鼠更为明显。MT属于可诱导蛋白,锌和氧化应激是其表达的重要诱导因素。本实验室前期研究表明,Zn诱导MT高表达对Dox心脏毒性具有明显的保护作用,推测其机制可能与MT清除体内自由基的功能有关,但具体作用机制还有待进一步深入研究。过氧化还原蛋白(Peroxiredoxins, Prxs)是新近发现的抗氧化酶系,广泛存在于各种生物体内。它在清除活性氧族中具有重要的作用,因其催化活性和蛋白序列与其它抗氧化剂完全不同,因此已成为近年来研究的热点。哺乳动物Prxs家族包括6个成员,即Prx-1～6。研究证明Prx-1、2、3、5和Prx-6存在于心肌细胞内。我们课题组前期研究应用基因组学和蛋白质组学技术方法,比较分析了MT+/+小鼠和MT-/-小鼠基因表达谱以及蛋白质谱的差异。结果发现,Prxs的部分亚型发生了变化,提示Prxs可能在MT发挥抗Dox心脏毒性作用中具有重要的作用。但二者之间究竟存在什么样的相互关系我们并不清楚。因此本实验研究的目的主要是：应用MT-/-小鼠和MT+/+小鼠及两种小鼠的心肌细胞体外原代培养模型,在体内和体外两个方面进一步研究并阐明MT与Prxs在发挥抗Dox所致心肌毒性作用时的相互关系与可能机制,为进一步研究MT的临床应用提供实验基础和理论依据。首先,在整体动物水平上研究了MT在抗Dox所致心肌毒性作用中与Prxs的关系。将20只MT+/+小鼠随机分为MT+/+对照组(NS组)和MT+/+给药组(Dox 15 mg/kg) 2组；20只MT-/-小鼠随机分为MT-/-对照组(NS组)和MT-/-给药组(Dox 15 mg/kg) 2组,每组均为10只动物。动物单次腹腔注射阿霉素4d后处死。为了验证实验动物模型的可靠性,采用血红素镉饱和法检测两种小鼠心肌组织内MT的含量,结果证明该实验模型可靠；通过对血液生化学、组织病理学和氧化损伤相关指标的检测,评价MT对Dox所致两种小鼠心肌损伤情况的影响。为了评价MT对心肌细胞抗Dox氧化损伤能力的影响,采用Western blot方法检测心肌组织内一般抗氧化物酶的表达水平。通过对两种小鼠心肌组织中Prxs蛋白表达水平的检测,进一步评价MT对Prxs表达的影响与相互联系。研究结果表明：①MT可抵抗Dox对心肌细胞的氧化损伤作用,表现为Dox能引起MT+/+小鼠心肌组织中MDA, CK, LDH等一些心肌损伤标志物的增高,而这些表现在MT-/-小鼠更为明显；②MT+/+小鼠的抗氧化能力明显高于MT-/-小鼠,表现为MT+/+小鼠的Dox组心肌组织内CAT、SOD-1等抗氧化物酶的蛋白表达显著性增高,而在MT-1小鼠的Dox组心肌组织内CAT、GSH-Px的蛋白表达显著低于MT+/+小鼠的Dox组；③Prxs在MT抗Dox心脏毒性的过程中发挥了重要的作用,并且这种作用可能与MT的表达水平存在一定的关系,表现为MT+/+小鼠的Dox组心肌组织中Prxs表达显著性增高,但是MT-/-小鼠的Dox组心肌组织中这些酶并没有发生显著性变化。以上结果提示MT在发挥抗Dox心脏毒性作用时,一般抗氧化物酶和Prxs可能参与其中。为了进一步研究MT抗Dox所致心肌细胞毒性的作用机制。我们利用来源MT-/-小鼠和MT+/+小鼠的心肌组织构建体外培养模型,并应用Zn诱导MT高表达,以分别形成MT缺失、MT正常表达以及MT高表达的心肌细胞模型。通过相关指标的检测,探讨在生理状态下和Dox致细胞氧化损伤的情况下,MT表达对Prxs的影响与相互联系。采用血红素镉饱和法检测心肌细胞MT浓度,证实Zn能诱导心肌细胞MT的合成。检测心肌细胞LDH的漏出率、存活率和凋亡率,评价ZnCl2诱导MT高表达的抗Dox所致心肌细胞毒性作用。采用H2-DCFDA荧光探针法检测细胞内ROS的生成量,评价MT高表达对Dox导致的心肌细胞氧化状态的影响。应用TBA比色法和彗星试验检测心肌细胞的脂质过氧化程度和DNA氧化损伤程度,评价MT高表达对Dox致心肌细胞生物大分子氧化损伤的影响。为了评价MT高表达对心肌细胞抗Dox氧化损伤能力的影响,检测心肌细胞内一般抗氧化物酶的活性。通过对Prxs蛋白表达水平的检测,进一步评价不同的MT表达水平对小鼠心肌细胞内Prxs表达水平的影响。研究结果表明：①ZnCl2可诱导MT+/+小鼠心肌细胞MT高表达,表现为给予ZnCl2的心肌细胞组的MT浓度为对照组的4倍。②ZnCl2可诱导MT合成从而发挥抗Dox所致心肌细胞毒性的作用。具体表现为：抑制Dox对MT+/+小鼠心肌细胞的毒性作用,降低心肌细胞LDH的漏出量和细胞凋亡率。③MT高表达可抑制Dox所导致的ROS的产生和抗氧化物酶活性的降低。④Dox可引起Prx-1、2、3、6蛋白表达的降低,并且在MT-/-小鼠上降低的更为明显。而Prx-5的表达水平在MT+/+表现为升高,在MT-/-小鼠上则表现为降低。⑤MT高表达可引起MT+/+件小鼠心肌细胞的Prx-2、3、5、6蛋白表达的升高,并且可以抑制Dox所引起的Prxs表达水平的变化。提示诱导MT高表达可清除心肌细胞内的ROS,抑制抗氧化物酶活性和Prxs表达水平的变化,提高心肌细胞的氧化防御能力,从而发挥抗Dox所致心肌细胞氧化损伤的作用。应用自由基清除剂(Trolox)和巯基耗竭剂(BSO)调节细胞氧化状态,观察二者对Dox致心肌细胞毒性作用的影响。并且在不同氧化防御状态下,进一步明确在发挥抗Dox所致心肌毒性过程中MT对Prxs的调节作用。通过对LDH的漏出量、细胞凋亡率、ROS的生成量、CAT和GSH-Px的活性检测,来评价Trolox和BSO对Dox致心肌细胞毒性和氧化防御状态改变的影响。结果表明：①Trolox可抑制Dox所导致的心肌细胞毒性和对心肌细胞的氧化损伤作用。主要表现在Trolox可降低Dox所导致的LDH漏出率增加,可清除细胞内ROS,抑制心肌细胞凋亡和DNA的氧化损伤。②BSO可加重Dox所致心肌细胞的氧化损伤反应,具体表现为增加Dox所导致的LDH漏出率的增加,增加ROS的产生,加重心肌细胞的凋亡和DNA氧化损伤。③Trolox可抑制Dox所致的MT+/+小鼠Prx-1、2、3、5、6蛋白表达的变化,而对MT-/-小鼠没有影响。BSO可使MT-/-小鼠的心肌细胞Prx-6蛋白表达下降,使其它亚型的Prxs蛋白表达升高。给予Dox后它可使MT-/-小鼠的心肌细胞的Prx-5、6进一步下降。以上结果表明,MT可通过清除细胞内的ROS,调节心肌细胞内抗氧化物酶的活性,来调节Prxs的表达水平,从而发挥其对Dox心脏毒性的保护作用。但同时MT还可以通过其它一些机制来调节Prxs的表达水平。本研究的创新点在于首次从整体动物和细胞两个方面研究了MT抗Dox所致心肌毒性的作用机制以及其对Prxs的调节作用。采用ZnCl2诱导MT高表达模型,应用Trolox和BSO使细胞处于不同的氧化状态,首次证明了MT在发挥抗氧化作用的过程中与Prxs的表达水平存在着一定的关系。在本实验条件下得出以下结论：①MT对Dox致心肌细胞氧化损伤有明显的保护作用,其机制与清除细胞内的ROS和保护抗氧化物酶的活性有关。②MT在发挥抗Dox所致心肌细胞毒性作用的过程中可调节Prxs的表达水平。③MT可通过清除细胞内ROS和抑制抗氧化物酶活性降低来调节Prxs的表达,但同时还可能存在一些其它的调控机制。