论文部分内容阅读
目的观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后血红素氧合酶-1（HO-1）基因表达及其催化产物一氧化碳（CO）浓度的变化,并探讨HO-1/CO系统在HIBD发生机制中的作用,以期为临床诊断、治疗新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）提供新的方法。方法1.制备HIBD模型:1.1 42只新生7日龄Wistar大鼠随机分为假手术对照组（Sham组）、HIBD1、6、12、24、48和72h组,每组6只。假手术组于手术恢复后24h处死。HIBD各组相应时间点处死。1.2 48只新生7日龄Wistar大鼠随机分为假手术对照组（Sham组）,生理盐水组（NS组）,血红素氧合酶抑制剂锌原卟啉组（Znpp组）和血红素氧合酶诱导剂氯化血红素组（Hemin组）,每组12只,24小时后处死。1.3将新生大鼠行颈正中切口,分离结扎左侧颈总动脉后给予低氧（8%O2,92%N2）处理2小时,制成HIBD模型。Znpp组和Hemin组于造模后分别予腹腔注射Znpp和Hemin 50mg/kg,NS组给予等量生理盐水作为对照。假手术组只予分离但不结扎左侧颈总动脉,亦不予低氧处理。2.神经行为能力检查:分别于手术前及缺氧后对每只新生大鼠进行翻身能力、夹尾左旋测试。3.脑大体形态观察:处死时观察每只新生大鼠脑组织的大体形态。4.HO-1基因表达、CO浓度、总超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、脑细胞凋亡率的测定:应用实时荧光定量PCR法测定HO-1基因表达,再取新鲜血应用双波长定量测定法检测CO浓度变化,应用黄嘌呤氧化酶法测定SOD,应用改良的硫代巴比妥酸法测定MDA,应用流式细胞术结合FITC-AnnexinV/PI双染法测定脑细胞凋亡率。结果1.神经行为能力检查术前90只大鼠翻身能力、夹尾左旋测定全部正常。术后Sham组检查未见异常。经历缺氧缺血的72只大鼠中,30只不能翻身,28只出现夹尾左旋,14只两种表现均存在。缺氧缺血开始10-15min新生鼠表现烦躁不安;20-30 min时全身紫绀或苍白、呼吸急促,随后活动明显减少、夹尾尖叫声减弱、翻身能力降低或消失、部分有肢体抖动、惊厥及嗜睡、昏睡、昏迷等意识障碍;恢复正常供氧1h后活动逐渐增加,4h后神经行为异常多消失。2.脑大体形态检查2.1 Sham组双侧大脑半球对称,无肿胀和（或）出血;HIBD组大鼠结扎侧半球脑组织受损,6h可见颜色苍白,12-24h苍白、水肿明显,体积明显大于对侧,部分脑表面有点状出血或脑室积血;72h可看到结扎侧半球肿胀开始减轻,额顶叶仍可见苍白区。2.2 NS组结扎侧半球脑组织苍白、肿胀,HO抑制剂组脑组织苍白,肿胀明显,甚至出现液化坏死,HO诱导剂组脑组织肿胀程度减轻。3.新生鼠HIBD后脑组织HO-1基因表达及全血CO浓度变化测定结果在Sham组HO-1基因表达及CO浓度极低,而在HIBD组,1h即见微弱的升高,随时间延长而逐渐升高,在12h达高峰,与其余各时间点相比差异有统计学意义（p＜0.01）,之后逐渐下降,72h时下降接近1h水平,各时间点水平均比对照组高,差异有统计学意义（P＜0.01）,CO浓度变化与HO-1表达趋势一致,两指标间成正相关（r=0.914,P＜0.01）。4.Sham组、NS组、Znpp组及Hemin组脑组织中SOD活力、MDA含量、脑细胞凋亡率、HO-1表达及血中CO浓度变化测定结果与Sham组比较,NS组、Znpp组、Hemin组HO-1基因表达均增强,CO浓度升高（P＜0.05）;与NS组比较,Znpp组HO-1基因表达明显减少,CO浓度降低（P＜0.05）;Hemin组二者均增多（P＜0.05）。NS组、Znpp组、Hemin组MDA含量及细胞凋亡率均高于Sham组（P＜0.05）,总SOD活力低于Sham组;与NS组比较,Znpp组MDA含量及细胞凋亡率明显增高（P＜0.05）,SOD活力进一步降低（P＜0.05）;Hemin组MDA含量及细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）,SOD活力回升（P＜0.05）。结论1.新生大鼠HIBD模型制作成功。2.新生大鼠HIBD后MDA含量增高,总SOD活力降低,证实存在自由基的损伤;脑细胞凋亡率升高,证实存在细胞凋亡。3.缺氧缺血后HO-1及其催化产物CO迅速升高,于HIBD后12h达最高峰,说明HO-1/CO系统可能在HIBD发病过程中发挥重要的病理生理作用。4.HO-1/CO系统在HIBD中具有一定的保护作用,通过抑制MDA产生,恢复SOD活力,抑制神经细胞凋亡实现缓解脑组织损伤的作用,为探讨新生儿HIE发生发展机制提供了新的切入点。5.应用HO抑制剂、诱导剂等人为改变HO表达水平可以加速或缓解HIBD进展,提示HO-1作为HIBD诊断及治疗的手段具有一定的临床前景。