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目的：
XJ-160病毒是1990年从我国新疆境内捕获的按蚊中分离到的一株病毒,经鉴定为甲病毒属辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)。目前本课题组已完成该病毒的全基因组序列测定,全基因组感染性cDNA克隆(pBR-XJ160)的构建及RNA型复制子载体系统的建立。但RNA型复制子载体的启动子为原核启动子,应用时需要进行体外转录,操作繁琐。与其相比,质粒型复制子载体可通过真核启动子(如CMV)启动转录,无需体外转录可直接转染到细胞中实现高水平外源基因的表达。鉴于此,本研究拟在pBR-XJ160基础上构建XJ-160病毒质粒型复制子载体系统,并对其进行定性、定量的功能鉴定。
方法：
1.XJ-160病毒质粒型复制子载体pVa-XJ的构建:以XJ-160病毒感染性全基因克隆pBR-XJ160为模板通过PCR将病毒非结构基因序列分为三个片段扩增:XJ1(1-2527nt),XJ2(2527-5161nt),XJ3(5161-7562nt),采用分步克隆的方法将其依次克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游,所用单一限制性内切酶分别为:NheI/BamHI,BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI,并用多克隆位点(multiple clone sites,MCS)序列替代病毒的结构基因,MCS由Nofl,PvuI,FseI,PaeI和AscI五种单一限制性内切酶酶切位点序列构成。
2.辅助质粒的构建:辅助质粒可为复制子载体反式提供病毒结构蛋白,以便包装出复制缺陷型的病毒颗粒,并最终提高载体的包装效率。因此,以感染性全基因克隆pBR-XJ160质粒为基础分别扩增病毒核蛋白基因C(7563-8354nt)及包膜糖蛋白基因E(8355-11297nt)分别将其克隆至pVAX1 CMV启动子下游构建载体的两个辅助质粒pVa-C和pVa-E,所用单一限制性内切酶分别为:EcoRI/XhoI和BamHI/XhoI。
3.复制子载体系统的功能鉴定:将绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorecentprotein,EGFP)报告基因及海肾荧光素酶(Gaussia Luciferase,GLUC)报告基因分别插入复制子载体的多克隆位点构建了含有报告基因的表达质粒pVaXJ-EGFP和pVaXJ-GLUC,所用单一限制性内切酶分别为:NotI/AscI和FseI/AscI。将报告基因表达质粒与辅助质粒共转染BHK-21细胞观察绿色荧光蛋白的表达情况及检测海肾荧光素酶的活性以对复制子载体系统进行定性、定量的功能鉴定。
结果
1.构建了XJ-160病毒质粒型复制子载体pVa-XJ,用引入的单一限制性内切酶NotI,PvuI,FseI,PacI和AscI均可以将载体质粒线性化,可获得长约10.5kb的线性载体片段;用NheI/BamHI,BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI双酶切均可获得长度约为2.5kb和8kb的线性片段,基因测序结果也表明所构建的载体序列正确。
2.构建了XJ-160病毒质粒型复制子载体的两个辅助质粒pVa-C和pVa-E,用单一限制性内切酶EcoRI/XhoI双酶切质粒pVa-C可得到长约0.79kb的核蛋白基因片段和长约3kb的线性pVAX1,用单一限制性内切酶BamHI或XhoI单酶切质粒pVa-E均可得到长约6kb的线性pVa-E片段,基因测序结果也表明所构建的辅助质粒序列正确。
3.对XJ-160病毒质粒型复制子载体系统进行定性的功能鉴定,用单一限制性内切酶NotI/AscI双酶切质粒pVaXJ-EGFP可得到长约0.7kb的EGFP基因片段和长约10.5kb的线性pVa-XJ,测序鉴定结果也显示我们成功构建了绿色荧光蛋白表达质粒。将pVaXJ-EGFP及辅助质粒pVa-C和pVa-E共转染BHK-21细胞,转染24h后观察到绿色荧光蛋白的表达。
4.对XJ-160病毒质粒型复制子载体系统进行定量的功能鉴定,用单一限制性内切酶FseI/AscI双酶切质粒pVaXJ-GLUC可得到长约0.59kb的GLUC基因片段和长约10.5kb的线性pVa-XJ,测序鉴定结果也显示我们成功构建了海肾荧光素酶表达质粒。将pVaXJ-GLtJC及辅助质粒pVa-C和pVa-E共转染BHK-21细胞,转染24h后我们所构建的复制子载体pVa-XJ所包装的Gluc在BHK-21细胞中的活性开始增强,至30h达到最高值(7.8×104)。在转染后30-48h载体所包装的G.luc的活性显著下降,48h时活性(3.0×104)。转染后6h-18h增长缓慢;由于G.luc表达量的快速增加和累加效应,至30h形成信号峰;此后缓慢下降。
结论
我们成功构建了基于XJ-160病毒感染性cDNA克隆的质粒型复制子载体系统,该复制子载体系统具有自主复制和翻译能力,可稳定表达外源蛋白。