论文部分内容阅读
研究背景和目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤遗传变异积累的复杂过程,目前认为其与EB病毒(Epstein BarrVirus,EBV)感染、化学促癌物和/或致癌物等密切相关。统计学资料分析表明,鼻咽癌不仅有家族集聚现象,10%的鼻咽癌患者有肿瘤家族史,而且存在基因组不稳定现象,说明遗传易感性/遗传倾向可能是鼻咽癌发病的一个重要因素。流行病学调查、家族聚集性研究、遗传模式分析等多种研究方法结果指出NPC是一个多基因遗传病,涉及多种瘤基因、抑瘤基因的改变,肿瘤相关基因在整个过程中起着重要作用。定位在染色体20q11.2的DNA序列中,全长1096bp,包括9个外显子和8个内含子的腭、肺及鼻咽上皮克隆基因——PLUNC(palate,lung and nasal epithelium clone,PLUNC)就是与鼻咽癌关系十分密切的基因之一,其表达下调可能有助于鼻咽癌的发生,为抑瘤基因的候选者,它在鼻咽癌中扮演了一个重要角色。根据相关文献报导,基因的启动子区单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)与相关疾病联系紧密。我们课题组曾对PLUNC基因功能性SNP位点进行了相关研究。通过大样本筛查发现hPLUNC基因启动子区多态位点C-1888T与中国人群鼻咽癌易感性关系非常密切,在此基础上进行的基因型分类也显示出携带基因型C-C的个体更易患鼻咽癌。表明hPLUNC基因的遗传多态性可能影响了中国人群鼻咽癌的易感性。但PLUNC基因启动子区多态位点C-1888T影响中国人群鼻咽癌的易感性具体机制如何呢?基于上述研究背景,我们拟研究hPLUNC基因启动子区多态位点C-1888T在转录水平上对PLUNC基因的表达的影响,探讨该位点不同基因型鼻咽癌易感性差异的原因,揭示罹患鼻咽癌的一个可能的因素,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制奠定理论基础。方法1、抽提鼻咽癌细胞株基因组DNA和鼻咽癌病人外周抗凝血的基因组DNA,采用聚合酶链式反应-测序方法及聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP),对样本DNA进行PLUNC基因启动子区1888 SNP位点及其附近SNP位点的筛查。分析样本DNA启动子区部分SNP基因型。2、根据前面的实验结果,利用PCR技术得到280bp含1888 SNP位点的目的片段(避开了筛查出来的已知或可疑的其他SNP位点),将其分别插入到pMD18-T载体和p GL3-enhancer荧光素酶报告基因载体中并测序。最后构建出2种基因型的荧光素酶表达载体(pGL3-Enhancer-TT和pGL3-Enhancer-CC),将之转染至鼻咽癌细胞HONE1后测定荧光素酶活性,以SPSS 13.0 for Windows软件的One-Way ANOVA和Dunnett’s T3多重比较方法进行统计学分析。3、以PLUNC基因启动子区1888 SNP位点为中心,合成31bp的G/C和A/T型四条序列探针,生物素标记后与CNE2细胞(其1888 SNP位点为杂合子C/T型)核蛋白进行电泳迁移率实验(Electrophoretic mobilityshift assay,EMSA)结合反应。结果1、从7株鼻咽癌细胞基因组DNA和鼻咽癌病人外周抗凝血的基因组DNA中,筛查出了1888 SNP位点的3种基因型,即CC型、CT型和TT型;并再次验证1888位点附近还有1个2128 SNP位点(在前期试验中已发现且证实),另外新发现2个可疑SNP位点(N1、N2)。经检索国内外文献及国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)均未发现N1位点的相关报道,而N2在NCBI上的SNP序列号为rs11907039。样本DNA PLUNC基因上游启动子区—437到+87bp序列中,除筛查出的已知和可疑SNP位点外,余序列与NCBI中已知序列一致。2、经测序证实,成功构建出含C-1888T SNP多态位点的荧光素酶表达载体;通过比较不同基因型荧光素酶表达载体(pGL3-Enhancer-TT和pGL3-Enhancer-CC)转染入细胞后的荧光素酶活性,发现1888 C启动子活性明显低于1888 T的活性,以SPSS 13.0 for Windows软件的One-Way ANOVA和Dunnett’s T3多重比较方法进行统计学分析,差异有统计学意义,P＜0.05。且其活性显著下降了约64.67%。3、EMSA结果示:仅见A/T探针常规反应组能与核蛋白结合,且移动得较慢,出现了阻滞条带;而G/C探针常规反应组不能与核蛋白结合。同时该两组阴性对照反应和特异性竞争抑制反应皆未有蛋白与生物素标记探针结合的反应。结论1、测序结果为后续荧光素酶活性检测提供了实验基础。并证明体外稳定建株的鼻咽癌细胞启动子区同样存在多态位点C-1888T,与人类基因数据库一致,可用于进行相关的体外研究。而N1位点是否为新的SNP位点抑或功能性的SNP位点,仍需进一步的实验研究加以证实。2、荧光素酶活性检测实验是自大样本流行病学调查研究后再证实了C-1888T可能是PLUNC基因启动子区功能性突变位点,而且进一步说明携带1888位点基因型C-C的个体更易患鼻咽癌可能是通过下调了PLUNC基因的表达而实现。3、EMSA实验进一步证明了PLUNC基因启动子区1888 SNP不同基因型其在转录水平上存在差异,其T基因型与转录因子结合能力明显强于C基因型。从而推断PLUNC基因启动子区1888 SNP位点由T突变为C后,转录活性可能因其与转录因子结合能力的减弱而下降,最终导致鼻咽癌易感性的改变。总之,我们通过荧光素酶活性检测和EMSA的方法在转录水平上检测了PLUNC基因启动子区1888 SNP位点的活性,结果提示我们1888 SNP位点由T突变为C后,其转录活性明显下降。而PLUNC基因作为抑瘤基因的候选者,其启动子区1888 SNP位点的突变增加了鼻咽癌的罹患率,是否跟其转录活性的下调有关?目前,其具体调控机制尚未完全明确,值得我们深入研究。