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研究目的:本研究在癌毒病机理论提出的结直肠腺瘤分期辨证观点基础上,通过分析结直肠腺瘤患者发病的相关因素及其与中医证型之间的关系,总结结直肠腺瘤分期辨证证型分布特点及规律;通过16S rDNA高通量测序技术及非靶向的气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）代谢组学技术对不同中医证型的结直肠腺瘤患者及健康人群肠道菌群结构及代谢组学特征进行差异性分析,进一步寻找结直肠腺瘤分期辨证主要证型湿热蕴结证和湿热毒蕴证的特征性菌群及代谢产物,探讨菌群及代谢紊乱在结直肠腺瘤向结直肠癌发生发展进程中的重要作用,从分子层面上阐释结直肠腺瘤分期辨证的实质与科学内涵。研究方法:本研究200例样本均来源于2018年11月至2020年9月就诊于江苏省中医院消化内镜中心病房经结肠镜检查及病理诊断为结直肠腺瘤的患者。健康对照组样本均来源于江苏省中医院体检中心的健康体检者以及经体检确认为健康的南京中医药大学研究生。采用16S rDNA高通量测序技术及非靶向的GC-MS代谢组学技术进行粪便样本的肠道菌群高通量测序及血浆样本的代谢组学检测。本研究第二部分为纳入患者的临床研究,收集结直肠腺瘤患者的临床资料,筛选符合纳入标准及排除标准的200例患者进行调查研究,填写《结直肠腺瘤中医证候调查表》,参照结直肠腺瘤分期辨证标准进行中医辨证分型,并进行各中医证型结直肠腺瘤患者发病相关因素分析。本研究第三部分为纳入患者的肠道菌群及代谢组学研究,共收集结直肠腺瘤患者的粪便样本和血浆样本各200例,其中脾气亏虚证44例,湿热蕴结证105例,湿热毒蕴证27例,气滞血瘀证24例,另收集同时期健康对照组粪便样本30例和血浆样本60例。采用16S rDNA高通量测序技术检测所有粪便样本,观察五组样本的菌群多样性和丰度变化情况,进一步比较湿热蕴结证组和湿热毒蕴证组菌群结构特征,探索寻找湿热蕴结证和湿热毒蕴证的肠道菌群潜在生物标志物。采用GC-MS代谢组学方法检测所有血浆样本,使用MS-DIAL和FiehnLib数据库处理采集的图谱信息,最终得到包含样本名称、代谢物信息及峰高值的三维矩阵数据集。矩阵数据采用MetaboAnalyst5.0在线网站进行偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis,PLS-DA）及正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）,然后根据对数转换进行单因素方差分析。根据倍数变化（Fold Change,FC）和非参数检验结果对结直肠腺瘤患者各组证型与健康人群进行差异性代谢物筛选与鉴定,随后采用MetaboAnalyst5.0对差异性代谢物涉及的代谢通路进行富集分析,根据通路的影响值确定相关的代谢通路,进一步寻找结直肠腺瘤分期辨证湿热蕴结证及湿热毒蕴证潜在血浆生物标志物及代谢通路。研究结果:1.本研究200例结直肠腺瘤患者中,男性144例,女性56例,男女比例为2.57:1;患者年龄覆盖27-70岁,平均年龄为56.62±9.10岁;所有年龄区间男性患者均多于女性;41-70岁年龄段患者占总人数的92.00%。2.结直肠腺瘤患者的中医证型分布从高到低依次为:湿热蕴结证>脾气亏虚证>湿热毒蕴证>气滞血瘀证。不同证型的结直肠腺瘤患者与BMI分类、腺瘤病理分型之间存在统计学差异（P<0.05）;不同证型的结直肠腺瘤患者与腺瘤部位、腺瘤数量、腺瘤大小之间均无显著差异（P>0.05）。3.采用16S rDNA高通量测序技术对不同证型的结直肠腺瘤患者与健康人群粪便的肠道菌群组成进行分析发现,结直肠腺瘤患者脾气亏虚证组、湿热蕴结证组、湿热毒蕴证组、气滞血瘀证组与健康对照组比较,其物种的多样性差异具有统计学意义（P<0.05）。从细菌门水平比较五组间肠道菌群组成发现,肠道菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门、放线菌门及其他菌门组成。拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和放线菌门在五组样本比较中,差异具有统计学意义（P<0.05）。其中脾气亏虚证组、湿热蕴结证组、湿热毒蕴证组、气滞血瘀证组拟杆菌门和梭杆菌门丰度较健康对照组明显升高,而厚壁菌门和放线菌门丰度较健康对照组则明显降低。从属分类水平上看,发现梭杆菌属和双歧杆菌属在五组样本比较中,差异有统计学意义（P<0.05）。其中脾气亏虚证组、湿热蕴结证组、湿热毒蕴证组、气滞血瘀证组梭杆菌属丰度较健康对照组升高,而双歧杆菌属丰度较健康对照组则明显降低。进一步比较湿热蕴结证组和湿热毒蕴证组菌群结构特征发现,两组间菌群的丰富度和多样性变化不明显。门水平上,两组相比,湿热毒蕴证组中拟杆菌门、梭杆菌门丰度增加,而厚壁菌门、变形菌门、放线菌门丰度则相对减少,但各菌门差异无统计学意义（P>0.05）。属水平上,两组相比,湿热蕴结证组Alistipes丰度增加,差异有统计学意义（P<0.05）。其他几个主要菌属虽在各组间含量波动范围有所差异,但经统计学分析后,均无统计学意义（P>0.05）。其中拟杆菌属、粪杆菌属、梭杆菌属丰度在湿热毒蕴证组中有升高趋势,普雷沃菌属9、狄氏副拟杆菌属及大肠杆菌-志贺氏菌属丰度在湿热蕴结证组中有升高趋势。通过LEfSe分析发现,在属水平上,副萨特氏菌属、产丁酸菌属、Faecalitalea、螺杆菌属在湿热毒蕴证组中富集;优杆菌属在湿热蕴结证组富集。4.采用GC-MS技术对结直肠腺瘤患者血浆进行了非靶向代谢组学分析,共筛选出氨基酸类、糖类、脂肪酸类、胆汁酸类、醇类及嘌呤嘧啶等108种血浆代谢物。进一步研究发现,结直肠腺瘤患者各证型组与健康对照组代谢产物具有一定的差异。四个证型组与健康对照组比较,共同的差异性代谢物有22个;湿热蕴结证组与健康对照组比较,有23个特征性差异代谢物;湿热毒蕴证组与健康对照组比较,有30个特征性差异代谢物。这些差异性代谢物涉及一系列脂肪酸、胆汁酸、氨基酸及能量代谢紊乱。各证型均涉及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸生物合成,柠檬酸循环（TCA循环）,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,丙酮酸代谢通路的紊乱。湿热蕴结证与湿热毒蕴证均存在乙醛酸和二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路的紊乱,其中湿热毒蕴证还存在氨酰-tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路的紊乱。此外,本研究还发现与湿热蕴结证比较,湿热毒蕴证组中存在花生四烯酸、胆酸、半胱氨酸-甘氨酸、天门冬氨酸的上调及亚油酸甲酯的下调。研究结论:1.本研究发现结直肠腺瘤患者男性的发病率普遍高于女性,中老年患者检出率较高。结直肠腺瘤分期辨证证型分布中实性病性证型以湿热蕴结证、湿热毒蕴证多见,虚性病性证型以脾气亏虚证多见。湿热蕴结和湿热毒蕴证患者的BMI主要分布在体重超重组。四种中医证型均以管状腺瘤最常见,绒毛状管状腺瘤最少见,绒毛状管状腺瘤在湿热蕴结证、湿热毒蕴证等湿热证候中更多见。2.结直肠腺瘤患者存在肠道菌群失调。各证型与健康对照组比较,其物种多样性具有明显差异。结直肠腺瘤不同中医分型及健康人群的肠道菌群的物种组成之间存在部分门、属水平上的差异,其中湿热毒蕴证患者肠道菌群中拟杆菌门、梭杆菌门、拟杆菌属、梭杆菌属上升趋势明显,而厚壁菌门较湿热蕴结证及健康对照组丰度降低。湿热蕴结证患者肠道菌群中Alistipes、优杆菌属丰度明显增加。肠道菌群结构的变化可以作为病证诊断及判断预后的特征性标志物。本研究发现厚壁菌门、拟杆菌属、梭杆菌属有可能成为区分湿热毒蕴证的潜在生物指标。因此,临床上以肠道菌群为切入点,通过调节肠道菌群或可干预结直肠腺瘤向结直肠癌的转变。3.结直肠腺瘤患者存在机体代谢物代谢紊乱的状态。我们对结直肠腺瘤患者各证型与健康对照组的血浆样本进行代谢轮廓分析,初步确定结直肠腺瘤患者各证型血浆样本呈现不同的代谢特征。湿热蕴结证组与湿热毒蕴证组存在代谢组学差异,具有差异性物质基础,湿热毒蕴证组中存在花生四烯酸、胆酸、半胱氨酸-甘氨酸、天门冬氨酸的上调及亚油酸甲酯的下调,涉及脂肪酸、胆汁酸、氨基酸及能量代谢紊乱。这些差异性代谢物的发现可能成为一种新的检测与诊疗手段,有利于临床更好地区分湿热蕴结证及湿热毒蕴证,为结直肠腺瘤分期辨证理论本质的研究奠定了重要的生物学基础。