论文部分内容阅读
第一部分脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响及细胞信号转导机制研究第一章脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响目的：脂联素（adiponectin）是脂肪细胞的特异性分泌因子，成骨细胞可表达脂联素受体，但脂联素对成骨细胞的作用机制尚未阐明。本研究首次探讨脂联素对人成骨细胞护骨素（osteopotegrin，OPG）和核因子κB受体活化素配体（receptor activator of NF-kappaB ligand，RANKL）表达的作用。方法：RT-PCR及Western印迹检测体外培养的人成骨细胞的脂联素受体（adiponectin receptor，AdipoR）mRNA及AdipoR蛋白表达。分别用0、3μg／ml、10μg／ml和30μg／ml脂联素干预人成骨细胞48 h，或分别用0、30μg／ml脂联素干预人成骨细胞0h、12h、24h和48h，干预前后OPG、RANKL的mRNA及蛋白表达分别用Real-time PCR和ELISA检测。结果：（1）人成骨细胞可表达AdiopR1 mRNA、AdiopR1蛋白和AdiopR2 mRNA；（2）脂联素呈剂量和时间依赖性地抑制人成骨细胞OPG的mRNA及蛋白表达；（3）脂联素呈剂量和时间依赖性地促进人成骨细胞RANKL的mRNA及蛋白表达。结论：脂联素可调节成骨细胞OPG和RANKL的表达，是骨代谢的调节因子之一。第二章脂联素对人成骨细胞OPG和RANKL表达影响的细胞信号转导机制目的：研究脂联素对人成骨细胞OPG和RANKL表达的细胞信号转导机制。方法：用小分子RNA干扰技术（siRNA）抑制AdiopR1表达，用30μg／ml脂联素单独干预人成骨细胞48h，或丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导阻断剂SB203580（p38MAPK阻断剂）或SP600125（c-Jun氨基端激酶，JNK阻断剂）在脂联素干预前2h加入，以观察脂联素对成骨细胞OPG和RANKL作用的细胞信号转导机制。OPG和RANKL mRNA的表达用Real-time PCR检测，MAPK中JNK、p38、ERK1／2及其磷酸化蛋白p-JNK、p-p38、p-ERK1／2用Western印迹检测。结果：脂联素通过AdipoR1激活p38MAPK；用AdipoR1-siRNA沉默AdipoR1的表达可阻断脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用；预先给予MAPK阻断剂SB203580阻断p38后，脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用亦被阻断。结论：在成骨细胞中，脂联素通过AdipoR1／p38途径促进RANKL的分泌，并抑制OPG的表达。第二部分重组组织金属蛋白酶抑制因子-3蛋白诱导鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡目的：研究重组组织金属蛋白酶抑制因子-3（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3，TIMP-3）蛋白对鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡的影响及细胞信号转导途径。方法：用100μg／L、200μg／L、400μg／L、600μg／L TIMP-3单独干预MC3T3-E1细胞，以观察TIMP-3对MC3T3-E1细胞凋亡的影响；600μg／L TIMP-3联合MAPK信号转导阻断剂SP600125（JNK阻断剂）、SB203580（p38阻断剂）或PD098059（ERK1／2阻断剂）干预MC3T3-E1，以观察TIMP-3作用于MC3T3-E1的细胞信号转导途径。细胞存活率和凋亡用MTT及ELISA检测，凋亡相关基因Fas、Fasl、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、cytochrome c的表达，以及丝裂原活化蛋白激酶JNK、p38、ERK1／2及其磷酸化蛋白p-JNK、p-p38、p-ERK1／2用Western印迹检测。结果：MTT及ELISA检测提示，TIMP-3呈剂量依赖性抑制MC3T3-E1细胞存活，呈剂量和时间依赖性诱导MC3T3-E1细胞凋亡。TIMP-1促进Fas、Fasl蛋白质表达，诱导cytochrome c的释放及caspase-8、caspase-3的活化，而对Bax、Bcl-2蛋白质的表达无影响。TIMP-3促进p38和ERK 1／2磷酸化，而PDO98059（ERK1／2阻断剂）和SB203580（p38阻断剂）消除p38和ERK 1／2介导的促凋亡作用。结论：TIMP-3通过死亡受体Fas途径介导成骨细胞MC3T3-E1凋亡，并通过诱导p38、ERK 1／2磷酸化的途径参与，促进MC3T3-E1细胞凋亡。