论文部分内容阅读
目的:对比观察基质细胞衍生因子(SDF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)及两种生长因子联合应用对大鼠股骨牵拉成骨(DO)愈合时间的影响。本实验旨在进一步阐明DO过程中的骨再生机理,为联合应用不同生长因子缩短DO的治疗周期提供新的思路。方法:雄性SD大鼠96只,随机分成4组,每组24只。建立左侧股骨DO模型,4组大鼠均行股骨中段截骨,安装外固定架固定股骨,经过5天的潜伏期,然后以0.25mm/12h的速度牵拉,连续10天,共延长5mm,随后进入固定期。从牵拉结束后(即固定期开始)于截骨端局部注射生长因子,1ml/次/d,连续1周。A组:注射PBS溶液;B组:注射含有100ng SDF-1的PBS溶液;C组:注射含有50ngVEGF的PBS溶液;D组:注射含有100ng SDF-1及50ngVEGF的PBS溶液。进入固定期后,不同时间段取材进行以下检测:(1)X线检查:每组随机选取6只SD大鼠分别于固定期2、4、6、8周行X线检查,观察牵拉端新生骨痂生成情况及骨质愈合情况;(2)Micro-CT检查:固定期4周,每组随机选取6只SD大鼠,行Micro-CT检查,并进行三维图像重建,观察牵拉端新骨生成情况,并测量新生骨组织体积(BV)、骨密度(BMD)等指标。(3)RT-PCR检测成骨相关基因:于固定期4周每组随机选取6只SD大鼠,取牵拉区新骨痂通过RT-PCR检测成骨相关基因:Runx-2(成骨分化关键性调控因子runt相关转录因子-2)、OPN(骨桥蛋白/骨调素)、ALP(碱性磷酸酶)、OCN(骨钙素);(4)组织学检测:固定期4周、8周(行X线检查8周结束的大鼠),每组随机选取6只SD大鼠,切取新生骨组织,HE染色观察各组新生骨痂组织结构;(5)生物力学检测:固定期4周的大鼠股骨行Micro-CT检查后行三点弯曲生物力学试验,通过检测牵拉区域新生骨组织的最大弯曲强度等指标来判断骨组织成熟度。结果:(1)X线检查:固定期第2周:A组牵拉间隙内未见明显新骨形成,B组和C组牵拉间隙内可见牵拉端两侧有少量新骨形成,B组外骨痂形成较明显;D组在牵拉间隙内可见明显新骨形成,牵拉间隙明显缩小。固定期第4周:A组牵拉间隙内有明显新骨形成,截骨线清晰可见;C组牵拉间隙已基本形成骨性连接,截骨线模糊;B组及D组股骨牵拉端全部为骨性连接,但B组牵拉间隙内骨痂密度低于D组。固定期第6周:A组牵拉间隙已基本形成骨性连接,截骨线模糊;B组、C组及D组股骨牵拉端全部为骨性连接,D组大鼠新生骨组织的重塑优于其它3组。固定期第8周:A组、B组、C组及D组股骨牵拉端全部为骨性连接,截骨线消失,外骨痂部分吸收,新骨开始塑形,D组大鼠新生骨组织的重塑优于其它3组。(2)Micro-CT检查:三维重建图像可见A组牵拉端两侧有新生骨组织生成,牵拉间隙明显,骨质不连续;B组、C组牵拉间隙已基本全部被新生骨组织填充,骨皮质基本连续,截骨线基本消失;D组牵拉间隙全部被新生骨组织填充,截骨线完全消失,骨皮质连续,与其它几组相比增厚明显增加。骨组织基本参数测量结果显示,D组新生骨组织体积(BV)和骨密度(BMD)明显高于其它3组,与A组、B组和C组之间有差异(P<0.05),任意两组之间均有差异(P<0.05),差异有统计学意义。(3)RT-PCR检测:D组大鼠的Runx-2、OPN、ALP、OCN等成骨相关基因表达量明显高于其它组,与A组、B组和C组之间有差异(P<0.05),B组、C组与A组两两之间均有差异(P<0.05),差异有统计学意义。(4)组织学检测:固定期4周HE染色:A组牵拉间隙内可见大量纤维组织及肥大软骨细胞,B组和C组牵拉间隙中心仍有少量纤维组织及软骨组织存在,而D组牵拉间隙内充满新生骨痂;固定期8周HE染色:A组牵拉端已基本形成骨性连接,但骨小梁数量较少、排列不规则,外骨痂明显;B组和C组牵拉间隙内骨小梁数量与A组相比显著增多、体积变大,B组骨小梁开始按照牵拉方向有序排列;D组大鼠骨皮质基本形成,骨小梁体积明显增大,沿牵拉方向排列,髓腔部分再通,新生骨组织成熟度明显优于其它3组。(5)生物力学检测:D组大鼠股骨最大弯曲强度明显大于其它3组,D组的抗弯曲强度与A组、B组及C组之间有差异(P<0.05),且任意两组之间均有差异(P<0.05),差异有统计学意义。结论:单独应用基质细胞衍生因子(SDF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)均可以促进DO过程中新骨的生成,缩短DO的治疗周期;但SDF-1比VEGF对牵拉成骨的促进作用更强;联合应用SDF-1和VEGF能实现骨与血供的联合重建,并能放大单一生长因子的效应,两者在生物学功能上形成互补,成骨效应优于其单独应用;这为生长因子的联合应用缩短DO治疗周期提供了一种新的具有可行性的方法。