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氮素是生物体内蛋白质、氨基酸等多种物质的组成部分,是植物生长最重要的矿质元素之一。氮素缺乏是农作物生长过程中存在的普遍现象,因此,大量施用氮肥是提高农作物产量的主要手段,据统计全球每年氮肥施用量约1亿吨,由此带来的资源浪费、环境污染等问题非常严重。目前,提高农作物氮素利用率的方法主要通过改进施肥方式及作物轮作等手段来实现,但并未从根本上解决作物氮素吸收率低下及大量施肥所带来的问题。大家都知道植物氮素的吸收利用与其自身基因有关,相关的铵转运蛋白主导着植物对外界环境中铵态氮的吸收,如果找到一种高效氮素吸收基因,并结合基因工程技术则很可能实现作物氮素吸收率的提高。随着工农业的发展,水体富营养化日益严重,水体氮磷营养盐过度积累,造成沉水植被衰退和消亡,水生植物群落结构趋向单一化,水生生态环境失去平衡。水葫芦具有过度吸收氮磷营养元素的特点,研究表明利用水葫芦进行水体修复可以降低富营养化水体营养盐浓度,提高水体透明度,提高水体中溶解氧含量,为沉水植被的生存创造有利的环境,能起到明显改善水质的效果。对水葫芦氮素吸收机理的研究可以从分子水平上揭示水葫芦进行水体修复的机制。水葫芦因其超强的繁殖能力,能在适度适宜的各种水体中旺盛生长,带来一系列的经济、环境问题,目前很多物理、生物防治方法似乎都不怎么凑效,若从水葫芦的营养代谢出发对水葫芦氮素吸收机制深入研究,从而有效控制水葫芦的生理生化状况,也不失为一条防治水葫芦的新途径。本文基于水稻、小麦等植物中铵转运蛋白(AMT, ammonium transporter)基因保守序列,以水葫芦根部RNA为模板经过两步法RT-PCR法扩增出水葫芦根部铵转运蛋白基因的保守序列片段,再经RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)法,克隆了水葫芦中第一个完整的铵转运蛋白基因(Eichhornia crassipes ammonium transporter, EcAMT)。 EcAMT cDNA全长1600bp,共编码501个氨基酸,软件预测其具有9个跨膜域,与小麦等植物具有较高的同源性,约达80%。通过BLAST分析及进化树构建可知EcAMT属于植物AMT1。将利用高保真酶扩增的EcAMT全长基因连接到穿梭质粒pYES2,然后将该重组子转化酵母突变株31019b(该突变株无法在铵离子作为唯一氮源且其浓度低于5mM的YNB培养基中生长),通过酵母突变互补功能鉴定实验表明,转化了该基因的酵母突变株能在低于5mM的铵离子浓度下正常生长,且其生长情况要优于野生菌,表明该基因具有较高的钱态氮吸收能力。本实验还通过半定量PCR及荧光定量PCR对清水、铵态氮及硝态氮三种不同培养条件下生长的水葫芦根部三种铵转运蛋白基因(分别标号为EcAMT1、 AMT2、AMT3)(?)的表达水平进行了分析,结果表明不同氮素形态下三种基因的表达情况各不相同,缺氮处理水葫芦根部72h后,EcAMT1的表达呈现明显的氮胁迫效应,但同时也具有时间效应性,即随着时间的变化,相同处理条件下其表达水平会发生变化。对处理72h后的水葫芦AMT2和AMT3进行半定量分析,发现AMT2呈现明显的铵诱导效应,而氮素形态对AMT3则没有明显的影响。