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为了克服抗生素作为饲料药物添加剂带来的种种弊端,世界各国的科学家努力寻求和开发无毒副作用的新型饲料添加剂,而微生态制剂尤其是益生菌正以其绿色安全的优点逐步成为替代抗生素类添加剂的主力军。
任何益生菌产生的作用都必须是在肠道环境下的,这是益生菌作用效果评判的基础。目前关于益生菌作用机制的研究多侧重于代谢产物分析及临床观察,以肠道环境为基础的机理研究较少。虽然不同动物消化道在解剖学和生理学上有所差异,但食入的益生菌必须耐受消化道中强酸性胃酸、高浓度胆盐及大量有抗菌活性的胃蛋白酶,才能抵达肠道的特定部位定植并发挥有益作用.为了保证菌株进入动物胃肠道后能起到抑制病菌的作用,还要求菌株有一定的抑菌能力。应用于生产的益生菌必须符合上面的要求,这就要进行一系列的益生特性评价实验。为寻找优良的益生菌株应用于生产,本研究以生物耗氧能力、产淀粉酶和产蛋白酶的能力对康地恩生物研发中心菌种库保存多株芽孢杆菌进行了筛选,然后对筛选到的优良菌株进行了体外益生特性评价,进而通过肉鸡饲喂试验研究了它的实际作用效果,为它的实际应用和枯草芽孢杆菌的作用机理研究做了有益的探索。本研究的主要研究结果如下:
(一)筛选获得优良枯草芽孢杆菌菌株:以芽孢杆菌生物耗氧能力、产淀粉酶和产蛋白酶的能力进行初筛。初筛实验结果表明,SC4、KR01、KR02、KD1、YB和S201对厌氧菌的促生长能力和产酶能力较强,因此选择它们进行复筛实验。以芽孢杆菌产淀粉酶和产蛋白酶的能力进行复筛。复筛实验结果表明,YB和KD1分别是产淀粉酶和蛋白酶能力最强的,因此对这两株菌进行了生理生化和分子生物学鉴定,并作了进化分析。综合形态学、生长特性和16S rDNA序列特征,将它们鉴定为Bacillus sublitis,并分别命名为Bacillus sublitis KD1和Bacillus sublitis YB。
(二)枯草芽孢杆菌YB和KD1的益生和代谢特性:对枯草芽孢杆菌YB和KD1进行了体外益生特性评价并研究了它们在模拟肠道环境下的生长代谢特性。结果发现两株枯草芽孢杆菌的耐热性和抑菌性没有显著区别,高温(85℃)处理后存活率都在90%以上,两者对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌均表现了出了一定的抑菌能力。两株菌对胃酸、胆盐的耐受性和对多种抗生素的常规用量耐受性都很强。在对胃酸和胆盐的耐受性上枯草芽孢杆菌KD1要优于YB,枯草芽孢杆菌YB对多种抗生素的常规用量耐受性要优于KD1。两株枯草芽孢杆菌的生长曲线和pH变化曲线变化趋势比较接近,枯草芽孢杆菌YB的产淀粉酶能力不高,而枯草芽孢杆菌KD1的产蛋白酶能力很高,最高值达到1369.3U(24h)。
(三)枯草芽孢杆菌KD1和YB影响肉鸡生长的机制研究:选用枯草芽孢杆菌KD1和YB发酵制成的成品进行肉鸡饲养实验,研究了其对肉鸡生产性能、肠道消化酶、黏膜免疫以及肠道菌群的影响,进而分析其作用机制。
(1)枯草芽孢杆菌KD1和YB对肉鸡生产性能的影响:实验结果表明,枯草芽孢杆菌KD1显著降低了各阶段肉鸡的死淘率,显著提高了肉鸡后期(22-42日龄)日增重和饲料转化率;而枯草芽孢杆菌YB却没有表现出类似的功能。
(2)枯草芽孢杆菌KD1和YB对肉鸡肠道消化酶水平的影响:实验结果表明,饲喂枯草芽孢杆菌后回肠淀粉酶酶活的变化与添加的芽孢杆菌浓度没有对应关系,蛋白酶酶活的变化与添加的芽孢杆菌浓度呈现对应关系。
(3)枯草芽孢杆菌KD1和YB对肉鸡盲肠中抗体水平的影响:实验结果表明,枯草芽孢杆菌KD1和YB对肉鸡盲肠中的不同抗体的影响是不同的,其中对SlgA的影响是最大的。在肉鸡生长的早期阶段(1-22日龄),枯草芽孢杆菌KD1和YB提高肉鸡盲肠中SIgA水平能力要强于其生长后期。枯草芽孢杆菌能显著提高肉鸡盲肠中的SIgA水平,增强肉鸡的免疫能力,降低肉鸡的发病率和死淘率,这和生产性能的结果是一致的。
(4)枯草芽孢杆菌KD1和YB对肉鸡盲肠菌群的影响:实验结果表明,枯草芽孢杆菌KD1能显著提高肉鸡盲肠内乳酸菌含量,降低大肠杆菌含量,枯草芽孢杆菌YB对肠道菌群改善有限。枯草芽孢杆菌KD1动物实验结果与体外促乳酸菌生长、抑制大肠杆菌生长实验结果一致,而枯草芽孢杆菌YB动物实验结果与体外促乳酸菌生长、抑制大肠杆菌生长实验结果不一致。
(5)枯草芽孢杆菌KD1和YB对肉鸡生长产生不同影响的可能原因:两者实验结果不一致说明了益生菌的益生作用不仅有菌株特异性,而且说明进入动物肠道内定植益生菌活菌数必须达到一定数量才能充分发挥益生作用。
(6)枯草芽孢杆菌影响肉鸡生长的作用机制:枯草芽孢杆菌通过分泌消化酶、增强机体免疫力和维护肠道微生态平衡等多方面机制来影响肉鸡生长状态,进而提高肉鸡生产性能。