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谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种非致病性棒杆菌，被广泛用于氨基酸的工业化生产，如L-赖氨酸。L-赖氨酸是人类和动物所需的八种必需氨基酸之一，由于具有多种功能而被广泛运用于多个领域。本文以谷氨酸棒杆菌野生型菌株（C.glutamicum ATCC13032）为出发菌株，根据代谢工程原理构建了一株高产L-赖氨酸的基因工程菌株。同时，为了克服因表达质粒介导的基因过表达存在的缺陷以及提高重组效率，本文开发了一种直接作用于谷氨酸棒杆菌基因组同时实现基因敲除和另一基因过表达而不带有任何抗性标记的新方法；并进一步通过Plackett-Burman（PB）法、CentralComposite Design（CCD）法和Response Surface Analysis（RSA）法对L-赖氨酸发酵培养基和发酵参数进行优化，进一步提高了目的重组菌株产L-赖氨酸能力，为实现利用基因工程菌株工业化生产L-赖氨酸提供理论依据和技术支持。主要研究结果如下：1.基于插入失活和双交换同源重组，开发了一种直接作用于谷氨酸棒杆菌基因组的遗传改造方法。该方法可以在基因组中同时实现基因敲除和另一基因的过表达而不带有任何抗性标记。插入在基因组中的过表达基因在宿主中能够稳定的遗传并表达。由于该方法运用双交换同源重组原理来获得目的重组菌株，这克服了单交换同源重组过程中低重组效率的缺点，从而大大提高获得目的重组菌株的机率。利用该方法对L-赖氨酸产生菌C. glutamicum lysCfbr进行遗传改造，获得的重组菌株C. glutamicum pck::lysCfbr alaT::fbp avtA::ddh摇瓶发酵48h后积累37.3±0.21mmol·L-1L-赖氨酸而未检测到L-丙氨酸，然而出发菌株C. glutamicum ATCC13032不能向胞外分泌L-赖氨酸。这一实验证明，该方法可以用于构建不带任何抗性标记的高产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株。2.异源表达E. coli中fbp基因（编码果糖-1,6-二磷酸酶，FBPase）和C. acetobutylicum中scrK基因（编码果糖激酶，ScrK），可提高糖蜜利用率和L-赖氨酸产量，从而降低生产成本。提高戊糖磷酸途径（PPP）中代谢通量对L-赖氨酸的合成起到重要作用，而FBPase和ScrK在补充PPP中的葡萄糖-6-磷酸起到重要作用。当以甜菜糖蜜为唯一碳源时，C. glutamicum lysCfbr菌体生长差，残糖浓度高，进入PPP途径中代谢通量少，且只积累了25.0±0.85mmol·L-1L-赖氨酸。在C. glutamicum lysCfbr中异源表达fbp或scrK基因不仅降低发酵液中残糖浓度，还增加了菌体量和L-赖氨酸产量。重组菌株C.glutamicum lysCfbr/pDXW-8-fbp-scrK摇瓶发酵48h后积累了47.1±2.36mmol·L-1L-赖氨酸，比出发菌株提高了88.4%。另外，在C. glutamicum lysCfbr异源表达fbp基因，其所编码的FBPase在一定程度上解除了分解代谢物的抑制作用。3.采用基因定点突变技术和基因敲除技术，降低了L-赖氨酸发酵过程中副产物积累和增加了L-赖氨酸前体物质及NADPH的供应，从而增加了L-赖氨酸产量。敲除aceE基因，增加了发酵液中丙酮酸的积累；敲除alaT和avtA基因，阻断L-丙氨酸的合成；敲除ldhA和mdh基因，降低乳酸和琥珀酸的积累；缺失AHAS小亚基IlvN中的C末端，显著降低AHAS的酶活力，从而降低了L-缬氨酸的积累；定点突变hom基因，降低HSD酶活力，从而降低了L-蛋氨酸和L-苏氨酸的积累。异源表达E. coli中pntAB基因或将C. glutamicum自身的NAD+-依赖型的GADPH替换成C. acetobutylicum中NADP+-依赖型的GADPH，可以有效的解除NADH对GADPH的抑制作用，提高菌体对糖的摄取率并提高NADPH的供应。获得的目的重组菌株C. glutamicum Lys5-3摇瓶发酵48h后积累59.1±5.73mmol·L-1L-赖氨酸，并只积累3.5±0.37mmol·L-1L-缬氨酸而未检测到L-蛋氨酸和L-苏氨酸。4.采用本实验构建的方法过表达谷氨酸棒杆菌中L-赖氨酸生物合成途径中6个关键性酶基因，即天冬氨酸激酶基因lysC、天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd、二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA、二氢吡啶二羧酸还原酶基因dapB、二氨基庚二酸脱氢酶基因ddh和二氨基庚二酸脱羧酶基因lysA，提高L-赖氨酸生物合成途径中的代谢通量，从而构建了重组菌株C. glutamicum Lys5-10。该菌株在7L发酵罐上发酵时，L-赖氨酸分泌主要在葡萄糖流加阶段，发酵48h后，L-赖氨酸最终产量达853±27.8mmol·L-（1即155.7g·L-1L-赖氨酸·HCl），葡萄糖转化率达47.2%。另外，发酵液中只积累了少量的丙酮酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸和L-苏氨酸，而并未发现L-丙氨酸、乳酸和乙酸。5.通过一系列的统计实验设计方法优化了重组菌株C. glutamicum Lys5-10的L-赖氨酸发酵培养基组成和发酵工艺参数。通过PB实验设计确定了影响L-赖氨酸合成的3个重要组成成分，分别为(NH4)2SO4、NaAc和L-丙氨酸。通过CCD和RSA分析L-赖氨酸生产的最优摇瓶发酵培养基（g·L-1）：葡萄糖100，甜菜糖蜜20mL，玉米浆30mL，(NH4)2SO447.3，NaAc31.7，尿素5，L-丙氨酸1.34，KH2PO42，MgSO4·7H2O1.35，FeSO4·7H2O0.02，MnSO4·H2O0.04，甜菜碱0.05，烟酰胺0.008，生物素0.001，硫胺素·HCl0.0006。通过CCD实验和RSA分析7L发酵罐中L-赖氨酸发酵实验最佳工艺参数：pH7.0、接种量为8%、搅拌速度为640r·min-1、温度为34°C和通气量为2.69L·min-1。用上述优化后的培养基组成成分和工艺参数在7L发酵罐中进行实验，通过分批发酵48h后最终L-赖氨酸产量达976±70.1mmol·L-1（即178.1g·L-1L-赖氨酸·HCl），葡萄糖转化率也提高到56.8%。