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群感效应是细菌根据细胞密度而调控细胞间信号应答的基因调控机制,但这种机制在其他生物中研究甚少。竹节状甲烷鬃菌(Methanosaeta harundinacea)6Ac是本实验室分离自厌氧颗粒污泥的甲烷古菌新种。该菌具有短杆(3-5μm)和长链状(>200μm)两种细胞形态,且与细胞密度相关,暗示在这种甲烷古菌中存在调控细胞形态变化的群感效应机制。本论文的目的是分析菌株6Ac可能产生的群感效应信号分子并初步探讨其调控机制,从而证明群感效应在原核生物中的普遍性。
论文第一部分利用高丝氨酸内酯报告菌株,检测到竹节状甲烷鬃菌能产生高丝氨酸内酯(AHLs)物质;用串联质谱检测到该菌产生10-14个碳原子的饱和酰基链的AHLs。半定量分析显示长链细胞产生的AHLs物质比短链细胞产生的高40倍。并且在其他三种甲烷菌的培养液中也检测到AHLs。为了证明AHLs是甲烷古菌的群感效应信号分子,我们在菌株6Ac的短链细胞培养液中添加了化学合成的N-(β-酮基)辛酰高丝氨酸内酯,结果显示该物质能够促进竹节状甲烷鬃菌的长链细胞形成。
已知细菌的luxⅠ基因编码高丝氨酸内酯合成酶,论文的第二部分则以细菌的luxⅠ为探针,在菌株6Ac的基因组中找到了同源基因fi1I。然后异源表达并纯化了FilⅠ蛋白,并通过检测其催化AHLs的生物合成活性从而鉴定其功能。报告菌株和质谱检测均显示FilⅠ蛋白的催化产物中含有和菌株6Ac培养液中相同的高丝氨酸内酯,说明FilⅠ蛋白具有合成AHLs的功能。而FilⅠ的信号感应域CHASFA的截短蛋白合成AHLs的水平和种类都降低,表明其重要性。
论文的第三部分初步分析了FilR蛋白可能的调控作用。通过用凝胶阻滞实验检测FilR蛋白与相应的基因启动子区域的结合。结果显示FilR可能参与调控filⅠ以及乙酸产甲烷的代谢基因。初步说明甲烷鬃菌中也存在LuxⅠ/R样的群感效应调控通路。