蝙蝠葛活性成分对HeLa细胞增殖、凋亡及其相关蛋白表达的研究

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目的:研究蝙蝠葛活性成分对人宫颈癌Hela细胞株抑制增殖和诱导凋亡作用,旨在进一步阐明蝙蝠葛的抗肿瘤作用及其机制,为新药开发提供实验和理论依据。  方法:应用MTT法检测蝙蝠葛活性成分对体外培养的人宫颈癌Hela细胞株增殖抑制作用及其细胞毒活性;通过倒置显微镜、HE染色、吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)染色及扫描电镜等方法观察肿瘤细胞的形态学改变;采用流式细胞仪检测Hela细胞株的细胞周期分布相和细胞凋亡率;通过免疫细胞化学S-P法测定细胞凋亡相关蛋白酶Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3,凋亡相关基因及产物bcl-2和Fas蛋白,增殖细胞核抗原Ki-67,细胞周期蛋白CyclinD1,候选抑癌基因Syk及核转录因子NF-κB的表达情况,深入探讨蝙蝠葛活性成分对人宫颈癌Hela细胞株的抑制增殖和诱导凋亡的作用机制。  结果:(1)MTT比色法结果表明:蝙蝠葛活性成分对人宫颈癌Hela细胞株有明显的抑制增殖作用,且这种抑制作用呈现明显的浓度和时间的依赖性;(2)倒置显微镜观察:蝙蝠葛活性成分40μg/ml作用后早期细胞出现凋亡形态学变化:细胞膜鼓泡、凋亡小体形成等;作用晚期细胞发生膜破裂坏死;(3)HE染色:蝙蝠葛活性成分40μg/ml作用细胞后出现典型凋亡形态变化:凋亡小体形成、细胞核浓缩呈蓝黑色、胞浆呈淡红色等,核染色质浓缩、呈碎块状;(4)吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)染色荧光显微镜下:活细胞核染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细胞,核染色质着黄绿色呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞,核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状;非凋亡的死亡细胞,核染色质着橘红色并呈正常结构;(5)扫描电镜观察结果:对照组的Hela细胞充分伸展,表面有丰富的微绒毛,且卷曲成丛状、规则排列、长丝突起分布均匀,微绒毛顶部有膨大的泡状物,细胞间隙清晰可见,连接不紧密,细胞膜完整。蝙蝠葛活性成分40μg/ml作用细胞后随着处理时间的延长,变化依次为胞体体积逐渐缩小,膜表面膨大的泡状物增大增多,呈凋亡早期的起泡现象,并见到个别细胞有突出的凋亡小体。贴近细胞膜表面,可见有的凋亡小体由细胞释出。最后,细胞表面的微绒毛完全消失,胞体固缩,细胞裂解成许多胞膜完整大小不一的凋亡小体状结构;(6)流式细胞仪检测结果显示:蝙蝠葛活性成分可以诱导 Hela细胞发生凋亡,加药组出现亚二倍体峰,并且G0/G1期细胞比例显著增加(P﹤0.01),而S期和G2/M期细胞比例则明显下降(P<0.01),将细胞阻滞在 G0/G1期;(7)免疫细胞化学结果表明:蝙蝠葛活性成分作用后加药组Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、Fas、Syk、和NF-κB表达增加,bcl-2、Ki-67和Cyclin D1蛋白表达降低,与对照组相比较均有显著差异(P<0.01)。  结论:  1、蝙蝠葛活性成分对人宫颈癌Hela细胞株具有诱导凋亡作用,其作用机制可能为NF-κB信号转导途径和 caspase途径共同参与完成凋亡的启动和执行。  2、蝙蝠葛活性成分对人宫颈癌Hela细胞株具有抑制增殖作用,可能与细胞周期阻滞有关;并且通过下调Ki-67、Cyclin D1蛋白,上调候选抑癌基因Syk的表达,抑制Hela细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用。  3、蝙蝠葛活性成分具有显著的抗肿瘤作用,有望开发成一种新的抗肿瘤药物。
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