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刺参(Apostichopus japonicus)是我国北方重要的珍稀海洋养殖品种之一,对刺参的免疫系统缺乏了解成为制约对其营养和免疫机制进行深入研究的瓶颈。NF-kB是动物天然免疫系统中的关键因子,调控着包括细胞因子在内的多种免疫基因的表达,溶菌酶是水产动物最重要的体液免疫因子之一,在天然免疫防御中发挥着重要的作用。本研究对刺参NF-KB信号通路中的Aj-rel和Aj-p105基因以及体液免疫基因Aj-lysozyme进行了克隆鉴定,并进行了蛋白表达以及功能研究,这将为进一步了解刺参的免疫防御机制以及开发新型免疫增强剂提供依据,主要实验内容与结果如下：(1)通过RT-PCR技术扩增得到了刺参Aj-Rel和Aj-p105基因的部分片段,利用3’RACE和5’RACE技术获得了刺参核转录因子Aj-rel和Aj-p105的全长序列。Aj-rel具有NF-KB蛋白特征性的RHD结构域及以及DNA结合基序和核定位信号,Aj-p105除具有上述结构以外,还有p105蛋白特有的锚蛋白重复结构域和DEATH结构域,进化树分析表明Aj-rel和Aj-p105分别属于“Rel类”和“NF-KB类”核转录因子。根据Genebank上发表的刺参lysozyme序列,通过RT-PCR技术扩增得到刺参Aj-lysozyme基因的全长序列,经测序正确后进行后续试验。(2)构建了Aj-rel和Aj-p105的原核表达载体,进行了重组蛋白的表达,利用Ni-NTA螯合亲和层析纯化方法对表达产物分离纯化后免疫动物获得抗体。Western Blot表明所制备的抗体可用于刺参Aj-rel,Aj-p105及Aj-p50的检测。用免疫共沉淀和Western Blot技术进行了Aj-rel和Aj-p105的相互作用的研究,结果表明Aj-Rel经免疫共沉淀后,经Western Blot可检测到Aj-p105和Aj-p50,说明Aj-Rel可分别同Aj-p105和Aj-p50形成二聚体,Aj-p105和Aj-p50经免疫共沉淀后,经Western Blot可检测到Aj-Rel,进一步证明了它们之间存在相互作用。(3)构建了刺参溶菌酶基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-lys,转化入酵母菌株GS115中筛选His+Muts型高拷贝转化菌株用于表达。经过表达条件优化确定表达高峰在192h(第八天),最佳甲醇浓度为1%,最佳pH为5,优化后的表达量可达50μg／ml。根据所确定的最佳表达条件进行重组刺参溶菌酶的表达,应用Ni-NTA螯合亲和层析方法纯化重组刺参溶菌酶,并进行抗体的制备。管碟法和比浊法研究纯化后的Aj-lysozyme的抗菌活性,表明与蛋清溶菌酶相比,Aj-lysozyme对溶壁微球菌和灿烂弧菌都表现出更强的抑菌活性。(4) Real-time PCR技术研究了LPS刺激后Aj-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的mRNA表达规律。Western Blot研究了LPS刺激后AJ-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的蛋白表达规律,表明LPS可通过NF-KB介导的信号通路发挥作用,刺参中NF-KB信号通路相关因子能够对LPS刺激做出快速反应,这与哺乳动物和昆虫中经典的NF-KB信号通路在功能上非常相似,表明NF-KB信号通路在功能上从刺参到人都很保守,在其天然免疫反应中发挥着重要作用。综上所述,本研究克隆了刺参的两个细胞免疫基因Aj-rel、Aj-p105和体液免疫基因Aj-lysozyme,分别在大肠杆菌表达载体和毕赤酵母表达载体中进行了表达,制备了相应的抗体,并进行了Aj-rel和Aj-p105相互作用以及重组Aj-lysozyme抑菌作用的研究,为了解刺参免疫系统的组成及其功能奠定了基础。LPS对Aj-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的mRNA水平和蛋白水平的影响的研究,将有助于了解Aj-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的表达规律,从而为深入了解刺参NF-KB信号通路的免疫调控机制,进一步开发免疫增强剂及实现刺参健康养殖提供理论指导。