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研究背景与目的:膳食因素是结直肠癌发病的重要影响因素之一,同时,膳食因素能够影响肠道菌群的构成和代谢功能。肠道菌群在结直肠癌的发病过程中发挥重要作用,其通过不同的途径参与到结直肠癌的发生发展中,主要涉及炎症反应和肠粘膜屏障等方面。肌醇六磷酸(Inositol hexaphosphate,IP6)是膳食中的重要成分,其具有抑制结直肠癌发生发展的作用,但作用机制尚不十分明确。研究表明IP6可以影响肠道菌群的构成。因此,本研究拟通过动物实验和体外实验,分析IP6对肠道菌群、炎症因子及肠粘膜屏障相关蛋白表达的影响,研究肠道菌群在IP6抑癌过程中的潜在作用,探讨IP6的抗癌作用机制,为IP6抑制结直肠癌提供理论基础和科学依据。方法:将60只Wistar大鼠随机分为五组,对照组(CG)、模型组(MG)、IP6低剂量组(LIPG)、IP6中剂量组(MIPG)和IP6高剂量组(HIPG)。LIPG、MIPG、HIPG大鼠每天进行IP6灌胃(0.25,0.5,1g/kg*d)。CG和MG大鼠分别给予等剂量的生理盐水灌胃。灌胃4周后,给予MG、LIPG、MIPG、HIPG大鼠剂量为30mg/kg的1,2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH)背部皮下注射建立结直肠癌模型。每周1次,共18周。诱癌结束后,继续喂养16周。实验期间记录大鼠的进食量和体重。实验结束后观察大鼠的成瘤情况,记录肿瘤质量,计算成瘤率、抑瘤率和瘤负荷。在IP6干预4周、22周(诱癌结束)、38周(实验结束)时,分别收集大鼠的粪便。利用16S r DNA测序方法对大鼠粪便菌群进行测序,信息分析方法包括α多样性指数、PCA、PCo A、NMDS、Lef Se等。实时定量PCR(RT-PCR)法检测CG大鼠结肠组织、诱癌组大鼠肿瘤组织中NF-κB、COX-2、iNOS、Claudin-1、E-cadherin mRNA的表达水平。免疫组织化学方法检测CG大鼠结肠组织、诱癌组大鼠肿瘤组织中NF-κB、COX-2、iNOS蛋白的表达水平。蛋白印迹(Western-blot)方法检测CG大鼠结肠组织、诱癌组大鼠肿瘤组织Claudin-1、E-cadherin蛋白的表达水平。ELISA法检测CG、MG、LIPG、MIPG、HIPG大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平。采用细胞增殖抑制实验观察不同浓度的IP6(1、2、4mmol/l)对结直肠癌细胞CT-26的增殖抑制作用;RT-PCR方法检测不同浓度的IP6(1、2、4mmol/l)干预对CT-26细胞NF-κB、COX-2、iNOS、E-cadherin、Claudin-1 mRNA表达的影响;蛋白印迹(Western-blot)方法检测不同浓度的IP6(1、2、4mmol/l)干预对CT-26细胞NF-κB、COX-2、iNOS、E-cadherin、Claudin-1蛋白表达的影响。结果:MG和LIPG大鼠的成瘤率均为100%,MIPG和HIPG大鼠的成瘤率分别为88.9%,66.7%。HIPG大鼠的平均瘤负荷显著低于MG大鼠(t=2.79,P<0.05),MIPG和HIPG大鼠的肿瘤质量显著低于MG大鼠(t=2.28、2.72,P均<0.05)。LIPG、MIPG和HIPG的抑瘤率分别为36.3%,67%和79.5%。IP6干预4周后,各组大鼠菌群在门水平的构成没有明显差异,在属水平的构成有明显差异。属水平的聚类热图结果显示,HIPG大鼠肠道明显聚集的菌属较多,主要包括Akkermansia、Allobaculum、Faecalibaculum、Roseburia、Lactobacillus等。PCA和PCo A分析结果显示,各组大鼠的菌群结构之间存在明显差异,主要体现在HIPG与CG、MG距离较远,说明HIPG与CG、HIPG与MG之间存在明显差异。HIPG组,Erysipelotrichaceae(科)、Allobaculum(属)丰度较高,显著高于其他四组(H=12.448、11.519,P均<0.05)。IP6干预22周诱癌结束时,厚壁菌门和拟杆菌门在5组大鼠肠道菌群中的相对丰度出现了较明显的变化,但是各组之间的差异性仍然没有统计学意义(F=1.57,1.76,P>0.05)。属水平的聚类热图结果显示,5组大鼠肠道均出现了明显聚集的菌属。PCA和PCo A分析结果显示,各组大鼠的菌群结构之间存在明显差异,主要体现在HIPG与CG距离较近。HIPG大鼠的Allobaculum(属)、Faecallbaculum(属)和Prevotellaceae(科)的丰度显著高于MG组的丰度(H=14.18~18.45,P均<0.05)。MG组大鼠Klebsiella(属)的丰度显著高于CG和IP6干预组大鼠的丰度(H=14.62,P<0.05)。IP6干预38周实验结束时,各组大鼠菌群组成有明显差异性,MG大鼠的厚壁菌门丰度显著高于CG和HIPG组(F=10.1,P<0.01),而MG大鼠的拟杆菌门丰度显著低于HIPG组(H=16.78,P<0.01)。属水平的聚类热图结果显示,除了LIPG之外,其他4组大鼠肠道均出现了明显聚集的菌属。PCA和PCo A分析结果显示,各组大鼠的菌群结构之间存在明显差异,主要体现在HIPG与CG距离较近,LIPG与MIPG距离较近且有重叠现象。Lachnospiraceae_NK4A136_group在CG的丰度显著高于MG(H=15.051,P<0.05),Escherichia-shigella、Bacteroides、Fusobacterium和Steptococcus四个菌属的变化趋势基本一致,均是在MG组丰度最高,显著高于CG和IP6干预组(H=17.07~19.63,P均<0.01)。Escherichia_coli(种)和Bacteroides_thetaiotaomicron(种)在MG的丰度显著高于CG和IP6各干预组(H=16.48、20.77,P均<0.01)。Allobaculum和Eubacterium在HIPG的丰度显著高于MG(H=18.35、16.23,P均<0.05)。RT-PCR和免疫组化结果显示NF-κB、COX-2、iNOS mRNA和蛋白表达呈现同样的趋势。MG的NF-κB、COX-2、iNOS mRNA和蛋白表达显著高于CG(t=11.14~18.33,P均<0.01),而IP6各干预组的表达显著低于MG(t=-3.88~17.33,P均<0.01),且随着干预剂量的增加,表达量呈现下降趋势。ELISA结果显示MG的TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著高于CG(t=7.30~15.25,P均<0.01),经过IP6干预后,TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著低于MG(t=2.56~10.09,P均<0.05)。随着IP6剂量的增加,呈下降趋势。肠粘膜屏障相关分子E-cadherin的mRNA和蛋白表达趋势一致,MG的表达水平显著低于CG(t=9.51、10.57,P均<0.01),IP6干预能够上调其表达水平(t=3.01~8.99,P均<0.05)。肠粘膜屏障相关分子Claudin-1的mRNA和蛋白表达趋势一致,MG的表达水平显著高于CG(t=5.63、14.03,P均<0.01),IP6干预能够下调其表达水平(t=2.64~8.42,P均<0.05)。Spearman相关分析结果显示,Escherichia_coli丰度与TNF-α、IL-1β、IL-6呈显著正相关(rs=0.671,0.701,0.707,P均<0.01);Fusobacterium丰度与TNF-α、IL-1β呈显著正相关(rs=0.413,0.439,P均<0.05),与IL-6无显著相关;Streptococcus丰度与TNF-α、IL-1β呈显著正相关(rs=0.398,0.487,P均<0.05),与IL-6无显著相关;Lachnospiraceae_NK4A136_group与TNF-α、IL-1β、IL-6呈显著负相关(rs=-0.692,-0.702,-0.667,P均<0.01)。Escherichia_coli丰度与Claudin-1呈显著正相关(rs=0.742,P<0.01),与E-cadherin呈显著负相关(rs=-0.758,P<0.01)。Fusobacterium丰度与E-cadherin呈显著负相关(rs=-0.444,P<0.05),与Claudin-1无显著相关。Streptococcus丰度与E-cadherin呈显著负相关(rs=-0.421,P<0.05),与Claudin-1无显著相关。Lachnospiraceae_NK4A136_group与Claudin-1呈显著负相关(rs=-0.715,P<0.01),与E-cadherin呈显著正相关(rs=0.708,P<0.01)。细胞增殖抑制试验结果显示,不同浓度的IP6干预对CT-26细胞呈现出了不同的抑制程度,1mmol/l、2mmol/l和4mmol/l IP6干预均能显著抑制CT-26的增殖(t=2.19~10.30,P均<0.05),其抑制率分别为11.16±12.84%、21.31±8.36%和53.36±10.32%。RT-PCR的结果显示,1mmol/l IP6干预对iNOS mRNA的表达没有显著影响(t=1.66,P>0.05),2mmol/l和4 mmol/l IP6干预组的iNOS mRNA表达量显著低于对照组(t=4.90、5.85,P均<0.01)。1mmol/l、2mmol/l和4 mmol/l IP6干预组的NF-κB、COX-2 mRNA表达量显著低于对照组(t=3.11~24.27,P均<0.05),呈现剂量反应趋势。IP6干预后,E-cadherin mRNA表达量呈现上升趋势,Claudin-1mRNA表达量呈现下降趋势,但是各组之间的表达量差异没有统计学意义(F=0.79、3.75,P>0.05)。Western Blot结果显示,IP6干预后,CT-26细胞NF-κB、COX-2、iNOS蛋白的表达呈现下降趋势。1mmol/l IP6干预组与对照组之间iNOS的蛋白表达量的差异无统计学意义(t=1.97,P>0.05),2mmol/l和4mmol/l IP6干预组的iNOS的蛋白表达量显著低于对照组(t=2.54、3.71,P均<0.05)。1mmol/l IP6、2mmol/l和4mmol/l IP6干预均能显著降低CT-26细胞NF-κB、COX-2的蛋白表达(t=2.51~9.41,P均<0.05)。IP6干预对肠粘膜相关蛋白E-cadherin和Claudin-1的表达产生了影响,IP6干预后E-cadherin的蛋白表达呈现上升趋势,Claudin-1的蛋白表达呈现下降趋势,但是各组之间的差异无统计学意义(F=3.06、2.54,P均>0.05)。结论:1.IP6能够影响DMH诱导结直肠癌大鼠的肠道菌群。IP6增加了大鼠肠道菌群的丰度和多样性;IP6能够降低厚壁菌门的丰度,增加拟杆菌门的丰度;IP6能够降低促炎致病菌Escherichia_coli、Fusobacterium、Streptococcus等的产生,增加肠道有益菌Lachnospiraceae_NK4A136_group的产生。2.IP6能够抑制结直肠癌大鼠模型血清炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,降低肿瘤组织中炎症介质NF-κB、COX-2、iNOS的表达;IP6能够对结直肠癌大鼠的肠粘膜屏障起到保护作用。IP6能够抑制CT-26结直肠癌细胞的增殖活性,显著下调CT-26细胞促炎因子NF-κB、COX-2、iNOS的表达,对CT-26细胞肠粘膜屏障相关蛋白没有明显的影响。3.Escherichia_coli、Fusobacterium等促炎致病菌与炎症因子之间呈现正相关性,可促进炎症进程,破坏肠粘膜屏障;Lachnospiraceae_NK4A136_group与炎症因子呈现负相关性,能够抑制炎症进程,保护肠粘膜屏障。4.肠道菌群在IP6的抑癌作用过程中起介导作用,IP6通过抑制促炎致病菌的产生、促进肠道有益菌的产生,从而阻碍炎症进程,修复肠粘膜屏障,以达到抑制DMH诱导的结直肠癌的作用。