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线虫在自然界中分布广泛,繁殖速度快,对动植物的侵染给人类造成巨大的经济损失。目前在防治线虫病害中仍然广泛采用的化学农药由于高毒性、高残留以及抗药性等问题,使得以线虫病原微生物为基础的生物防治成为重要选择之一。在大量的有关线虫生物防治的研究中,现已证明杀线虫微生物在侵染线虫过程中的凝集素基因,胞外侵染性蛋白酶基因和几丁质酶基因等通过病原和宿主的相互识别、侵入或者杀死宿主参与侵染过程。定植于植物根部的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens FZB42)是一种具有显著促植物生长及抑制植物病害能力的革兰氏阳性芽孢杆菌。我们的生测实验也提示,它也具有强大的杀线虫活性。在解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株全基因组测序完成的有利背景下,通过构建全基因组的随机突变文库,我们对该细菌参与线虫侵染相关的新致病基因进行了研究。
在前期构建了解淀粉芽孢杆菌FZB42随机突变文库的基础上,通过线虫生测实验,共计筛选了随机突变文库中的300个突变子,最终得到杀线虫活性减弱的5个突变子,然后通过反向PCR技术对其中一株突变子F5进行突变基因的克隆,初步拟定了3个候选的突变基因,分别是hypotheticalprotein(RBAM_007470),prkA(RBAM_009250)和yhdV(RBAM_009870)。最后对上述3个新的与线虫侵染相关的候选致病基因的其中一个通过回复突变的方法进行了验证,鉴定得出hypothetical protein(RBAM_007470)基因没有完全回复F5的突变性状,说明这个基因可能跟其它基因协同参与对线虫的侵染,或者只是一个不相关的随机突变。
本研究所取得的主要创新性结果包括:
1,通过线虫生测实验,从解淀粉芽孢杆菌随机突变文库的300个突变子中筛选出5个侵染线虫活性显著下降的突变子,分别为F5、E23、F21、F35以及B54。为鉴定在B.amyloliquefaciensFZB42中与侵染线虫相关的的新功能基因提供物质基础。
2,利用反向PCR技术,从侵染线虫能力明显降低的突变子F5中克隆出3个基因。分别为hypothetical protein(RBAM_007470),prkA(RBAM_009250)和yhdY(RBAM_009870),并确定利用反向PCR方法来克隆转座子插入的靶标基因的可行性。
3,对筛选到的与线虫侵染相关的新候选基因进行功能验证。构建了解淀粉芽孢杆菌的HP(hypothetical protein)基因的回复表达突变株,通过比较基因回复表达突变株与原始F5突变子的杀线虫活性,结果显示hypotheticalprotein(RBAM_007470)没有完全回复F5的突变性状,说明这个基因可能跟其它基因协同参与对线虫的侵染,或者只是一个不相关的随机突变。