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本文研究目的：
1.研究细胞周期调控蛋白p27kip1及其相关分子在国人非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma，NHL)中的表达，初步分析p27kip1相关细胞周期调控紊乱与国人NHL发生发展的关系。
2.克隆人类p27kip1基因，构建其真核表达载体，初步分析外源性p27kip1蛋白表达对淋巴瘤细胞增殖的影响。
3.研究化疗药物鬼臼乙叉甙(VP16)及血清饥饿对淋巴瘤细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响，初步探讨p27kip1在此过程中的作用。
研究方法：
1.以免疫组织化学技术检测我国常见的6大类100例NHL病理组织标本及20例反应性增生淋巴组织中p27kip1蛋白的表达；采用Westernblot、免疫荧光化学法和激光共聚焦技术并结合以前的部分实验结果研究p27kip1和cyclinD3在NHL中的表达、定位及相互关系；采用免疫组化技术研究cyclinE、Rb和cyclinA等p27kip1相关蛋白在65例B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)中的表达；结合增殖指标及其他资料初步分析p27kip1相关的细胞周期调控紊乱与国人NHL发生发展的关系。
2.采用RT-PCR技术扩增人类p27kip1cDNA全长序列，通过DNA重组技术将其重组于pcDNA3.1及pEGFP-N2载体，构建p27kip1正、反义真核表达质粒及p27-EGFP融合蛋白表达质粒，通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。采用阳离子脂质体法将p27-EGFP融合蛋白表达质粒转染进入Raii细胞，以免疫荧光技术分析内源性和外源性p27kip1蛋白在Raji细胞内的表达、定位及与增殖指标Ki67蛋白的关系。
3.以MTT法、流式细胞术及Hochest染色法检测VP16和血清饥饿对淋巴瘤细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响，通过Westernblot技术检测p27kip1蛋白在此过程中的表达变化。
研究结果：
1.总体而言，p27kip1蛋白在国人NHL组织内的表达低于反应性增生组，且与肿瘤的侵袭性及增殖活性呈负相关；以前的研究发现cyclinD3是与国人NHL关系最为密切的D类周期蛋白，本实验发现国人NHL中p27kip1与cyclinD3的表达呈负相关，但在少数高增殖的病例及个别淋巴瘤细胞株中出现了p27kip1与cyclinD3的共同高表达并共定位；cyclinE及cyclinA在国人B-NHL中的表达水平高于反应性增生组，与肿瘤的侵袭性及增殖活性呈正相关，与p27kip1的表达呈负相关；Rb蛋白在B-NHL与对照组间的表达情况没有明显差异。
2.本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27kiplcDNA；阳离子脂质体法介导p27-EGFP融合蛋白表达质粒转染的效率为5％～10％；不同Ki67蛋白表达水平的Raji细胞，其内源性p27kip1的荧光强度基本一致；外源性p27kip1在Raji细胞内的表达情况有三种：①外源性的p27kip1能够进入细胞核，Ki67信号很弱甚至检测不到，②外源性的p27kip1仅局限于细胞浆，细胞核内可见中等强度的Ki67阳性信号，③在Ki67强阳性或处于有丝分裂期的Raji细胞中检测不到外源性p27kip1的表达。
3.VPl6(5ug/ml)对淋巴瘤细胞活性具有很强的抑制作用，在极早期即能诱导细胞发生凋亡；Jurkat细胞对VPl6的敏感性高于Raji；在此过程中没有检测到p27kipl蛋白水平的明显变化。血清饥饿能够抑制淋巴瘤细胞活性，诱导淋巴瘤细胞发生G0/G1期生长阻滞；Jurkat细胞对血清饥饿的敏感性高于Raji；血清饥饿引起细胞内p27kip1蛋白水平的增高，且与细胞周期的变化趋势相吻合。
研究结论：
1.p27kip1蛋白表达的降低、cyclinE和cyclinA表达的增高与国人NHL的发生及肿瘤侵袭性和增殖活性的升高密切相关。Rb蛋白与国人NHL的发生没有直接关系。少数NHL病例及细胞中p27kip1蛋白的异常表达及其与cyclinD3的共定位，提示p27kip1与cyclinD3的相互作用也可能参与了NHL的发生发展。
2.构建了人类p27kipl基因的正、反义真核表达质粒和p27-EGFP融合蛋白表达质粒。Raji淋巴瘤细胞中内源性的p27kip1的表达与细胞增殖状态无明显关系；外源性的p27kip1对Raji细胞的增殖具有抑制作用，但可能要以p27kip1顺利进入细胞核为先决条件。
3.VP16对于淋巴瘤细胞具有很强的抑制作用，在极早期即可诱导细胞发生凋亡，但p27kip1蛋白水平在此过程中没有明显变化。血清饥饿能够抑制淋巴瘤细胞活性，引起细胞周期阻滞，并且上调p27kip1蛋白表达。