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随着生物法生产食品、燃料、药物、添加剂的需求量不断上升，代谢工程为背景的蛋白质工程技术也面临着新的挑战。为了在发酵法或酶催化中实现新产品合成或高产的需求，开发新酶、设计和修饰途径关键酶以获得新的功能等蛋白质工程技术成为合成生物学中重要的策略。本论文聚焦蛋白质工程技术与生物催化剂发现研究，从半理性设计脱氢酶的辅因子利用与新型苯丙酮酸脱羧酶功能鉴定两个方面来展开研究。 L-天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(L-Aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase，ASADH)辅因子利用的改造为蛋白质工程的半理性设计工作。天冬氨酸途径是微生物与植物的必需合成途径，ASADH位于第一分枝的关键结点位置，途径的终端产物甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸与异亮氨酸被广泛用于添加剂，因此该途径在工业应用领域具有重要价值。此外，天冬氨酸途径并不存在于哺乳动物中，ASADH常被作为重要抗菌靶点，开发抑制剂药物，因此ASADH的底物催化、辅因子利用等机理研究具有重要意义。在细菌中，ASADH高度依赖NADP+，几乎不能利用NAD+。已有研究中关于ASADH辅因子利用的信息十分有限，目前尚未有报道其野生型或某种突变体能够有效利用NAD+，因此，ASADH是辅因子利用研究十分理想的选择。本部分聚焦于ASADH的辅因子利用研究，利用蛋白质工程进行半理性设计鉴定了该酶活性中心NAD(H)利用热点残基，其中大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ecASADH-Q350N与ecASADH-Q350N/H171A两个突变体展现出显著提高NAD(H)利用的能力，其催化效率kcat/Km比野生型分别提高了44倍与66倍。进一步解析了突变效应机理并在模拟辅因子生理浓度进行多酶级联反应，实现利用NADH进行L-高丝氨酸的体外合成。 维吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiaee)来源的新型苯丙酮酸脱羧酶的功能鉴定为生物催化剂发现工作。苯丙酮酸脱羧酶(Phenylpyruvate decarboxylase，PPDC)是焦磷酸硫胺素(Thiamine pyrophosphate,TPP)依赖型的脱羧酶，可催化苯丙酮酸发生非氧化脱羧生成苯乙醛。PPDC存在于芳香化合物的代谢途径中，目前仅在几种微生物中鉴定到其活力，其中只有酵母(Saccharomyces cerevisiae)与巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)来源的ScPPDC与AbPPDC得到了较详细的生化鉴定。AbPPDC的晶体结构得到解析，对PPDC酶催化研究具有重要指导意义，目前并无维吉尼亚链霉菌来源的SvPPDC的报道。ScPPDC位于酵母的欧利希代谢途径，苯丙氨酸首先通过转氨作用形成苯丙酮酸，再在ScPPDC的催化下生成苯乙醛，最后经还原酶还原为高级醇一苯乙醇。苯乙醇具有玫瑰香味，可作为香水或化妆品的添加剂而具有重要应用价值。由于大肠杆菌中没有PPDC，通过代谢改造大肠杆菌的莽草酸途径，再结合欧利希途径中的酶可合成如苯乙醇、苯乙酸等多种有价值的化学品，因此开发芳香化合物途径的酶在合成生物学中具有重要意义。此部分聚焦于维吉尼亚链霉菌中的bkdC与bkdD基因的功能研究，经过结构域分析与生化验证，证实BkdC/BkdD蛋白共表达可催化苯丙酮酸合成苯乙醛，两个蛋白为PPDC的两个亚基，功能协同，是维吉尼亚链霉菌来源的新型PPDC。我们利用HPLC精确定义了这对互作蛋白的动力学参数，其对底物苯丙酮酸的转换数kcat与已报道的ScPPDC相当，约为0.3min-1，但对苯丙酮酸的亲和力比其高一倍，因此催化效率kcat/Km比ScPPDC高一倍，具有重要应用价值。 综上所述，本论文从蛋白质半理性设计与新酶开发两方面的蛋白质工程技术对ASADH与PPDC进行了研究。第一部分工作对ASADH进行辅因子利用的改造与分子机理研究，获得了能够高效利用NAD(H)的ASADH，改变野生型ASADH难以利用NAD(H)的局限，并解析了辅因子利用的相关机理，实现利用NADH进行L-高丝氨酸的高效体外合成。此研究结果拓展了对ASADH辅因子利用分子机理的认识，也为脱氢酶的辅因子改造工程提供新的思路和策略。同时在第二部分工作中通过对维吉尼亚链霉菌来源的BkdC/BkdD在大肠杆菌中进行了共表达与功能鉴定，证实了BkdC/BkdD为SvPPDC的两个亚基，二者不可分割，共同发挥PPDC的功能，与已有报道的PPDC的单体形式不同，是新型的PPDC。由于其催化效率比ScPPDC更有优势，所以具有潜在的工业价值。研究结果拓宽了PPDC的来源和形式，可为其他互作蛋白的原核表达提供新的策略，也为合成生物学所需生物催化剂提供更多选择。