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胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖等的诱发而分泌的蛋白质激素,通过细胞的信号转导发挥调节糖、脂肪和蛋白质代谢,影响生殖以及衰老等生长发育过程的作用。胰岛素信号传导途径是一条进化保守的信号传导途径,多种物种的衰老机制都涉及到胰岛素信号转导通路,利用低等生物来研究复杂的寿命现象成为可能。本文通过家蚕全基因组数据库资源进行挖掘分析,利用RT-PCR、RACE、RNA干涉等技术对Ir及Foxo基因进行了全基因克隆分析、表达模式分析以及初步的功能鉴定工作,同时还对限食与饥饿对家蚕不同组织的胰岛素/胰岛素样生长因子信号系统同源基因Akt、Ir、Foxo-s、Pdk、Irs、Ir-lp、Sirt2、Foxo、Pi3k60和Pi3k110表达影响进行了研究工作,形成结果如下。1 Ir与Foxo基因的家蚕序列数据库信息挖掘分别以黑腹果蝇和埃及伊蚊等物种的IR与FOXO同源蛋白质序列为质询序列,同源比对NCBI、SILKDB等生物数据库中家蚕全基因组数据库和EST数据库,发现在家蚕基因组中存在6条潜在的转录编码FOXO保守结构域序列,3个Ir同源基因,其中1个为已经克隆的家蚕Ir基因,另一个为未被克隆的表皮生长因子基因,还有1个为缺失Ir膜内激酶区的同源蛋白(命名为IR-LP)。Tblastn发现,家蚕基因组中有5条潜在的转录编码表皮生长因子蛋白序列片段,有2条潜在的编码未知IR同源蛋白序列片段。2家蚕Ir-lp、Foxo与Rtpk基因的cDNA克隆及分析根据基因挖掘线索,实验克隆了基因Ir-lp和Foxo,以及只有激酶区的一段相似最高的潜在编码序列(命名为Rtpk)。家蚕Foxo基因最大ORF框为1 641 bp,编码546氨基酸,分子量为59574.45 D,具有较长的5′UTR和较短的3′UTR,在92 to 181氨基酸位置具有FOXO蛋白的Forkhead (FH)典型结构域,属于转录调控因子家族。同源比对分析表明,该基因编码蛋白与人的FOXO3和FOXO1、果蝇的FOXOA和FOXOE、以及线虫的daf-16同源性较高,与果蝇的同源关系最近,与人与线虫的相差较大。克隆的家蚕胰岛素受体类似蛋白基因Ir-lp,其最长ORF框为1 812 bp,编码604个氨基酸残基,具有受体L臂和纤维连接蛋白3的结构域,3’RACE的结果证实,其没有像胰岛素受体类似激酶结构域,与基因挖掘预测结果一致,前400个氨基酸残基与人类和果蝇的同源蛋白高度保守,进一步说明克隆的基因为IR家族家蚕同源基因。在家蚕基因组IR蛋白质同源编码序列挖掘过程中,发现了1个与Ir基因激酶区序列同源性最高的只包括激酶区约400个氨基酸残基的序列。cDNA片段克隆分析结果显示,其编码的蛋白质属于蛋白酪氨酸激酶家族,为受体型酪氨酸蛋白激酶,其激酶序列与人类、果蝇和线虫高度保守。3 Ir与Foxo基因的表达模式5龄第3日幼虫期Ir基因的表达量在8个调查的组织间差异不大,血淋巴中相对较低;而Ir-lp基因的表达量在组织间差异显著,头部组织含量最高,其次为血淋巴和马氏管,最低为脂肪体。胰岛素受体的类似物基因Ir-lp在催青3d的胚胎中有较高的表达量,而4d的胚胎中下降。1-3龄起蚕Ir-lp基因有高峰值表达,5龄起蚕脂肪体中表达量下降,5龄第7d和熟蚕期出现波动,蛹期开始逐渐上升,蛹和成虫无论雌雄均有较高表达量。推测蛹和成虫期的Ir-lp表达上调可能与提高幼虫期储存的能量利用效率有关,其它时期的上调机理无法判断。Foxo基因在血淋巴中有高于其它组织1倍的表达量,Foxo-s序列在各组织均有一定水平表达,其中脂肪体有高于中肠1倍的表达量。在催青3-4d胚胎、以及1-4龄起蚕中,Foxo-s基因几乎不表达,5龄前期幼虫的脂肪体中,该基因有较高水平表达,但随着生长有下降的趋势,并在化蛹前1 d升高,并在蛹和成虫期维持较高的表达量。Foxo基因在大部调查的家蚕时期的表达量均较低,只有1龄、蛹期和蛾期的少数时期有较高量表达。Rtpk基因在调查的发育时期中有显著的变化,催青3d胚胎中表达量较高,然后表达下调,从2龄幼虫(全蚕)一直到5龄7d的脂肪体中,全部都维持在较低的表达量,熟蚕期有突然的表达量上调,然后预蛹期降低,蛹期、蛾期的表达量相对较高,并且雌雄存在一定的差异。4 Ir与Foxo基因的RNA干涉下调表达合成了5个dsRNA干扰物,筛选确定了其中Ir600和Foxo520两个具有明显的干涉效果的片段,其有效浓度分别为1-20 nmol/L与1-10 nmol/L,有效干扰时间为处理后2-5d。在无血清的培养基中,家蚕BmN细胞逐渐凋亡坏死。5 nmol/L Foxo520干涉处理后5 d,凋亡细胞少于阴性对照,活细胞也较多;提示Foxo基因可能对血清缺乏诱导的细胞凋亡具有促进作用。Grace培养基培养的家蚕BmN细胞,在5 nmol/L Ir600 ds RNA处理3-6d,5 d时凋亡细胞数较对照组有显著增加。提示Ir基因的下调可能致使细胞凋亡。5限食与饥饿对家蚕不同组织胰岛素信号系统同源基因表达的影响成功复制了家蚕限食模型,利用该模型调查了长期限食与短时饥饿对家蚕5龄幼虫不同组织中10个胰岛素信号系统同源基因表达的影响。结果显示,长期限食后的进食状态家蚕,大于一半的基因在性腺、中肠、体壁中呈上调,马氏管、头部和血液中呈下调;饥饿刺激对自由进食的家蚕的影响,除了Foxo-s与Irs基因在性腺组织中上调外,更多基因则在马氏管与头部表现下调;饥饿刺激对长期限食家蚕的影响,表现为所有基因在马氏管和头呈上调趋势,在性腺中更多是下调趋势;长期限食对饥饿状态的家蚕影响,表现为更多基因在多数组织中表达上调,其中在马氏管与中肠最为明显,而生殖腺的情况则相反。