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研究目的有研究表明,机体长期处于慢性应激状态下,将导致HPA轴功能亢进,糖皮质激素分泌增多,最终损伤海马神经元。自噬是细胞受到外界刺激后产生的一种自我保护机制,这种机制对损伤的神经元细胞至关重要,但自噬过度激活将导致其内环境紊乱,使其功能受损甚至死亡。四逆散出自《伤寒论》,由柴胡、枳实、白芍、炙甘草四味药物组成,具有疏肝解郁、调和肝脾之功。课题组前期实验忆证明四逆散可以改善慢性应激大鼠抑郁样行为。故本实验以原代海马神经元细胞为研究对象,利用皮质酮建立体外慢性应激细胞模型,通过Western-blot、Real-timePCR、免疫荧光等现代实验技术,从蛋白、基因等层面探讨慢性应激的致病机理以及中药四逆散的作用机制,为中医药治疗慢性应激提供新的理论依据。实验方法1、根据相关文献培养原代海马神经元细胞并在显微镜下观察4h、24h、48h以及5-7天的生长情况,第7天采用免疫荧光法鉴定所取原代海马神经元细胞。2、利用CCK-8法检测不同时间段(6h、12h、24h、48h)和不同浓度皮质酮(0μM、5μM、1OμM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、600μM、800μM)海马神经元细胞生存率。并根据皮质酮浓度将其分为6组0μM、10μM5、50μM、100μM、200μM、400μM。采用 Western-blot 法检测 LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1 自噬蛋白以及 PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-70s通路蛋白表达量。筛选出最佳皮质酮浓度。3、利用Western-blot和Real-timePCR法检测空白组、模型组、10%空白血清组、10%四逆散血清组、20%空白血清组、20%四逆散血清组、30%空白血清组、30%四逆散血清组海马神经元LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1蛋白以及基因表达量,并利用免疫荧光法检测以上各组LC3蛋白表达量。筛选出四逆散抗皮质酮损伤海马神经元的最佳浓度。在此基础上,利用Western-blot法检测20%空白血清组、20%四逆散血清组、20%空白血清组+3-ma、20%四逆散血清组+3-ma海马神经元LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1蛋白表达量。4、利用Western-blot和Real-timePCR法检测空白组、模型组、10%空白血清组、10%四逆散血清组、20%空白血清组、20%四逆散血清组、30%空白血清组、30%四逆散血清组海马神经元PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-70s蛋白以及基因表达量,在此基础上,利用Western-blot方法检测20%空白血清组、20%四逆散血清组、20%空白血清组+雷帕霉素、20%四逆散血清组+雷帕霉素以及20%空白血清组、20%四逆散血清组、20%空白血清组+siRNA-NC、20%空白血清组+siRNA-mTOR、20%四逆散血清组+siRNA-mTOR 海马神经元 PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-70s 蛋白表达量。利用CCK-8法检测20%空白血清组、20%四逆散血清组、20%空白血清组+3-ma、20%四逆散血清组+3-ma、20%空白血清组+雷帕霉素、20%四逆散血清组+雷帕霉素海马神经元细胞生存率。实验结果1、新生SD大鼠原代海马神经元细胞的形态学观察:培养细胞4h后,神经元细胞开始贴壁,贴壁的神经元细胞成圆形、椭圆形或者梭形,部分细胞长出小突触;培养细胞24h后,海马神经元细胞胞体增加,其形态由圆形变为三角形、梭形,突触长度以及数量增加;培养细胞48h后,细胞具有折光性,突触进一步增长,可见部分突触相互连接形成网络;培养细胞5-7天:细胞胞体折光性强,形态饱满,边界清晰,突触间相互连接成致密的网络结构,细胞有一定聚集现象,高倍镜下可观察到明显的细胞核,且细胞胞浆均匀一致,立体感强;2、新生SD大鼠原代海马神经元细胞免疫荧光鉴定:海马神经元胞体饱满,突触粗大形成网络,这与形态学图片一致,其细胞纯度在90%以上;3、不同浓度皮质酮对海马神经元细胞生存率的影响:当皮质酮作用在海马神经元细胞 6h,与0μM组比较,100μM、200μM、300μM、400μM、600μM、800μM 组细胞生存率下降(P<0.01),有统计学意义;当皮质酮作用在海马神经元细胞12h,与0μM组比较,800μM组细胞生存率下降(P<0.01),有统计学意义;当皮质酮作用在海马神经元细胞24h,与OμM组比较,5μM、10μM组细胞生存率升高(P<0.01),有统计学意义;100μM、200μM、300μM、400μM、600μM、800μM组细胞生存率下降(P<0.01),有统计学意义;当皮质酮作用在海马神经元细胞48h,与0μM组比较,5μM组细胞生存率增加(P<0.01),有统计学意义;50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、600μM、800μM组细胞生存率下降(P<0.01),有统计学意义;4、不同浓度皮质酮对海马神经元自噬蛋白的影响:与0μM组比较,10μM、50μM、10μM、200μM、400μM 组海马神经元 LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1 蛋白表达量增加(P<0.01),有统计学意义;5、不同浓度皮质酮对海马神经元PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响:与0μM组比较,10μM组海马神经元PI3K、p-Akt、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量增加(P<0.01);有统计学意义;p-mTOR蛋白表达量增加(P<0.05),有统计学意义;50μM组海马神经元PI3K、p-70s蛋白表达量增加(P<0.01),有统计学意义;p-Akt、p-mTOR蛋白表达量增加(P<0.05),有统计学意义;p-4E-BP1蛋白表达量减少(P<0.01),有统计学意义;100μM组海马神经元PI3K、p-Akt、p-4E-BP1蛋白表达量减少(P<0.01),有统计学意义;p-mTOR蛋白表达量减少(P<0.05),有统计学意义;200μM、400μM 组海马神经元 PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1 蛋白表达量减少(P<0.01),有统计学意义;6、不同浓度四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元生存率的影响:与空白组比较,模型组海马神经元生存率下降(P<0.01),有统计学意义;与相应浓度空白血清组比较,四逆散血清组(10%、20%、30%)海马神经元细胞生存率均增加(P<0.05、P<0.01、P<0.05),有统计学意义;7、不同浓度四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元自噬蛋白的影响:与空白组比较,模型组海马神经元LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1蛋白表达量均增加(P<0.01),有统计学意义;与相应浓度空白血清组相比,四逆散血清组(10%、20%、30%)海马神经元LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1蛋白表达量均下降(P<0.01),有统计学意义;8、不同浓度四逆散对皮质酮损伤海马神经元自噬mRNA的影响:与空白组比较,模型组海马神经元LC3、Beclin1、ULK1 mRNA相对表达量增加(P<0.01,P<0.05,P<0.05),有统计学意义;与10%空白血清组比较,10%四逆散血清组海马神经元Beclin1 mRNA相对表达量降低(P<0.01),有统计学意义;与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元LC3、Beclin1 mRNA相对表达量减少(P<0.01),有统计学意义;与30%空白血清组比较,30%四逆散血清组海马神经元Beclin1 mRNA相对表达量减少(P<0.01),有统计学意义;9、不同浓度四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元LC3免疫荧光的影响:与空白组比较,模型组海马神经元LC3斑点密度增加(P<0.01),有统计学意义;与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元LC3斑点密度减少(P<0.01),有统计学意义;与30%空白血清组比较,30%四逆散血清组海马神经元LC3斑点密度减少(P<0.01),有统计学意义;10、3-ma介导20%四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元自噬蛋白的影响:与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1蛋白表达量下降(P<0.01),有统计学意义;20%空白血清组+3-ma海马神经元LC3-II/LC3-I、Beclin1、ULK1蛋白表达量下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01),有统计学意义;与20%空白血清组+3-ma比较,20%四逆散血清组+3-ma海马神经元ULK1蛋白表达量下降(P<0.01),有统计学意义;11、不同浓度四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元PI3K/Akt/mTOR通路的影响:与空白组比较,模型组海马神经元PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均下降(P<0.01),有统计学意义;与10%空白血清组比较,10%四逆散血清组海马神经元PI3K、p-Akt、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均增加(P<0.01),有统计学意义;与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均增加(P<0.01),有统计学意义;与30%空白血清组比较,30%四逆散血清组海马神经元p-70s、p-4E-BP1、p-mTOR蛋白表达量均增加(P<0.01、P<0.01、P<0.05),有统计学意义;12、不同浓度四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元PI3K/Akt/mTOR通路mRNA的影响:与空白组比较,模型组海马神经元Akt、mTOR、70s、4E-BP1 mRNA相对表达量减少(P<0.01),有统计学意义;与10%空白血清组比较,10%四逆散血清组海马神经元mTOR mRNA相对表达量增加(P<0.01),有统计学意义;与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组Akt、mTOR、4E-BP1 mRNA相对表达量增加(P<0.01),有统计学意义;与30%空白血清组比较,30%四逆散血清组海马神经元mTOR、70s、4E-BP1、AktmRNA相对表达量增加(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05),有统计学意义。13、雷帕霉素介导20%四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响:与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均增加(P<0.01),有统计学意义;20%空白血清组+雷帕霉素马神经元p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均减少(P<0.01),有统计学意义;与20%四逆散血清组比较,20%四逆散血清组+雷帕霉素海马神经元p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均减少(P<0.01),有统计学意义。14、siRNA-mTOR介导20%四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的影响:与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元p-mTOR、p-70s、p-4E-BP 1蛋白表达量均增加(P<0.01),有统计学意义;20%空白血清组+siRNA-mTOR海马神经元p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均减少(P<0.01),有统计学意义;与20%四逆散血清组比较,20%四逆散血清组+siRNA-mTOR海马神经元p-mTOR、p-70s、p-4E-BP1蛋白表达量均减少(P<0.01),有统计学意义。15、3-ma/雷帕霉素介导20%四逆散血清对皮质酮损伤海马神经元细胞生存率的影响:与20%空白血清组比较,20%四逆散血清组海马神经元细胞生存率增加(P<0.05),有统计学意义;与20%四逆散血清组比较,20%四逆散血清组+雷帕霉素海马神经元细胞生存率下降(P<0.05),有统计学意义;与20%空白血清组+3-ma比较,20%四逆散血清组+3-ma海马神经元细胞生存率增加(P<0.01),有统计学意义。与20%空白血清组+雷帕霉素比较,20%四逆散血清组+雷帕霉素海马神经元细胞生存率增加(P<0.01),有统计学意义。实验结论1、小于50μM皮质酮可以增加海马神经元细胞生存率;50-800μM皮质酮,且随着作用时间和浓度的增加,海马神经元细胞生存率逐渐降低;2、200μM皮质酮可以抑制海马神经元PI3K/Akt/mTOR信号通路,激活海马神经元自噬;3、四逆散血清可以增加皮质酮损伤的海马神经元细胞生存率;4、四逆散血清可以抑制皮质酮损伤的海马神经元过度自噬;5、四逆散血清激活皮质酮损伤的海马神经元PI3K/Akt/mTOR信号通路。