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药物筛选是整个药物发现和发展过程的起点.进入21世纪以来,随着分子生物学,人类基因组和功能基因组学的发展,大量可用于疾病治疗的靶标不断涌现:另一方面,来自天然产物提取纯化,加上由组合化学合成的化合物数量的快速累积,可以构建起数以百万计的化合物库,为新药的筛选提供了基础.但如何从数以百万计的化合物库中筛选出具有生物活性的化合物仍然是新药开发的瓶颈.因此,发展和建立快速、可靠、低成本和高通量的药物筛选技术对于研发创新药物具有重要的现实意义.
本论文的目的是建立基于亲和毛细管电泳技术的药物筛选方法,实现简单易行的药物筛选.
第一章对现有的药物筛选技术进行了评述,详细介绍了近年来分离分析技术特别是液相色谱技术、色谱-质谱联用技术、毛细管电泳技术用于药物筛选的最新进展.
第二章建立了一种基于前沿亲和毛细管电泳研究药物-蛋白的别构效应的新方法.该方法无需对蛋白和小分子药物做任何修饰或标记,在接近生理环境的条件下通过测定蛋白与小分子药物多级结合参数,就能获得描述别构效应的数据.实验以人血清白蛋白、小分子药物(华法林钠、(S)-布洛芬,(R)-布洛芬)、血红素为研究模型,通过多波长选择性地分别检测药物分子、血红素二者与蛋白的结合,证明了血红素和药物分子与人血清白蛋白是别构型结合,即,人血清白蛋白结合血红素后能够降低人血清白蛋白与这两个药物的亲和力,产生负别构效应.应用前沿亲和色谱方法,在不同的血红素浓度下,我们定晕测定了人血清白蛋白与药物分子结合常数的变化,确证了血红素结合人血清白蛋白后可以改变蛋白结合华法林钠的高亲和力口袋的构象,和蛋白结合布洛芬低亲和力口袋的构象.由布洛芬、华法林钠与人血清白蛋白竞争性结合实验证明蛋白结合布洛芬的低亲和力位点就是结合华法林钠的高亲和力位点.本文还首次定量测定了该人血清白蛋白的别构效应对布洛芬对映体亲和力影响的差异,结果表明在蛋白变构后(S)-布洛芬与蛋白亲和力的改变更为显著.与传统的方法相比,我们发展的方法具有好的普适性,可以用于别构类药物的筛选.
第三章建立了一种基于亲和竞争毛细管电泳的蛋白激酶抑制剂的筛选方法.我们设计合成了基于抗肿瘤药物达沙替尼的荧光探针分子,将其用于ATP竞争型激酶抑制剂的筛选.首先,我们测定了荧光探针分子与靶标蛋白Abl的结合常数,作为衡量待筛选化合物与靶标蛋白亲和力大小的标杆.将待筛选化合物与荧光探针分子、靶蛋白共同孵育,如果待筛选化合物与荧光探针分子结合在靶标蛋白的同一位点,由于竞争作用,一定量的荧光探针从蛋白复合物中解离出,通过测定待筛化合物顶替出的荧光探针浓度,依据建立的数学模犁,就可以定量测定靶标蛋白与待筛化合物的结合常数.该方法的优势在于:无需对待筛化合物或激酶蛋白标记,无需激酶特异性底物,只需探针,靶标蛋白,就可以评价待筛选化合物与靶标蛋白的亲和力,是一种通用型的药物筛选方法;高灵敏度的激光诱导荧光检测结合毛细管电泳的纳升级进样量,大幅度降低了探针和激酶的使用量;可以对抑制剂结合常数进行排序,研究活性化合物的构效关系,为活性化合物进一步结构优化提供帮助.将本课题组发展的蛋白活性测试方法结合本章发展的基于亲和力的筛选方法,可以使得筛选结果更加可靠,全面,并最终用于别构抑制剂的筛选.
第四章建立了一种改进的前沿亲和毛细管电泳方法,该方法可用于小分子药物-人血清白蛋白结合常数的测定.本方法采用聚电解质动态双涂层修饰毛细管壁,可以有效克服蛋白质在毛细管壁上的吸附,提高蛋白迁移时间重复性以及游离药物分子峰高重复性,从而提高亲和力测定的准确性及可靠性;同时,该方法节省了反复用氢氧化钠冲洗毛细管柱时间,提高了检测效率.实验中以人血清白蛋白和6种药物分子为模型分子,定量测定了这6种药物分子与人血清白蛋白结合常数及结合位点数.通过对比在未涂层柱上及在涂层柱上的测定结果确定了该双涂层并不影响蛋白质与药物分子的结合.