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程序性死亡因子(programmed death 1, PD-1)是CD28家族的一员,主要表达在活化的T、B细胞和单核细胞。PD-1有两个配体:PD-L1和PD-L2,它们的细胞表达谱差别很大。PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合,可以降低T细胞受体介导的细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒作用。阻断PD-1-PD-L通路,可以使效应T细胞数量增加且功能加强。在体内,PD-1-PD-L通路参与多种疾病的免疫调控,包括自身免疫性疾病、肿瘤、移植免疫、慢性病毒感染、寄生虫感染和过敏反应等。某些病原也能引起猪的持续性感染,如猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS),引起免疫抑制和持续性感染是该病的重要特点。PD-1-PD-L通路在其中是否发挥作用还没有文献报道。本研究试图通过制备抗猪PD-1分子的特异性单抗,为以后研究其在猪的免疫抑制性疾病中的作用和免疫抑制机制提供物质基础。为此,本试验构建了表达猪PD-1的原核表达载体,在大肠杆菌中进行了诱导表达,将表达蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,制备了抗猪PD-1蛋白的单克隆抗体,并对其配体PD-L1进行原核表达。试验结果如下:1构建了表达猪PD-1基因的原核表达载体pGEX-6P-PD-1,在大肠杆菌DH5α中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析证实获得了相应大小的融合蛋白。同时筛选了融合蛋白表达所需的最佳培养条件。2通过电洗脱法对PD-1融合蛋白进行了纯化,得到纯度较高的目的蛋白。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞用50 %PEG(4000)进行融合。构建表达PD-1基因的真核表达载体pcDNA3.1-PD-1,转染293T细胞,收集转染细胞固定在玻片上制备抗原片,用间接免疫荧光法检测融合后存活的细胞。通过有限稀释法筛选得到1株阳性杂交瘤细胞株,命名为2B7。通过Western blot分析,该杂交瘤细胞培养上清能够与GST-PD-1融合蛋白反应,而不与GST标签反应,说明其分泌的抗体是特异性针对猪PD-1的单克隆抗体。通过流式细胞仪检测证实该单克隆抗体可以识别分泌到细胞上的PD-1分子。经液氮冻存后复苏并传代培养证明2B7杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体。3将2B7杂交瘤细胞注入用液体石蜡预处理过的小鼠腹腔,制备了高效价的腹水。应用间接免疫荧光方法检测细胞株培养上清效价为1:1×210,腹水的效价可达1:2×105以上。应用免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒检测该单克隆抗体为IgG1亚型。4构建猪PD-1的配体之一的PD-L1的原核表达载体,并对其进行诱导表达,筛选其最优表达条件:在37°条件下,1mM的IPTG诱导4h表达量最大。在本研究中,我们获得了一株稳定分泌抗猪PD-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对猪PD-1的配体之一PD-L1进行原核表达,为进一步研究PD-1-PD-L通路在猪的感染性疾病中的作用奠定了基础。