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1.目的：
采用离体肠菌厌氧孵育法，以液质联用技术分离分析半夏泻心汤及不同配伍中黄酮类、皂苷类及生物碱类成分在肠道菌群作用下的代谢特征;并采用Caco-2细胞模型研究其单体、有效组分配伍的肠道吸收特征。结合前期血药浓度吸收研究，探讨复方配伍中有效成分生物利用度存在差异的原因，为探寻半夏泻心汤的药效物质基础，初步阐明其配伍理论的科学内涵和实质提供有益尝试。
2.方法：
(1)运用离体肠菌厌氧环境孵育法，将大鼠直肠内容物制备成肠菌培养液，在合适的厌氧条件下将半夏泻心汤及其配伍溶液（半夏泻心汤全方组、甘补组、苦降组、黄芩组、人参组、黄芩组）与肠菌培养液按1∶9的比例进行温孵，分别于不同时间点取出样品，加甲醇0.5ml终止反应。样品经过甲醇提取处理，用LC-MS/MS方法分析测定半夏泻心汤全方组及不同配伍组中黄酮类、皂苷类、生物碱类成分在肠道菌群体系中不同时间点的含量变化，利用公式求解各成分的降解速率，并通过时间与浓度的关系制得代谢过程图，比较不同配伍组的代谢规律。
(2)采用Caco-2细胞模型研究半夏泻心汤中有效组分及其配伍的吸收特征。运用MTT细胞毒性实验，测定半夏泻心汤中有效组分系列浓度的细胞存活率，并考察不同配伍组对细胞毒性的影响。对主要单体成分（黄芩苷、甘草苷、小檗碱、人参皂苷Rb1）进行细胞摄取特性考察，使用考马斯亮蓝试剂盒测定摄取实验中各样品的蛋白浓度，计算各组分的细胞摄取量。通过将Caco-2细胞接种于Millipore聚碳酸酯膜的小室，21d后测其跨膜电阻＞500Ω/cm2时，将供试溶液（单体及其配伍、半夏泻心汤有效组分配伍）分别加入AP与BL两侧，运用LC-MS/MS方法测定不同转运方向下的浓度变化，通过计算表观渗透系数以及外流率，考察药物的转运吸收特征，比较不同配伍情况下有效组分的细胞转运吸收差异。
3.结果：
(1)建立了同时测定半夏泻心汤在肠菌代谢体系中黄酮类8个成分（黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素）的LC-MS/MS测定方法。所建立的分析方法简便快速、稳定可靠。比较各成分在单方、不同配伍组的代谢结果，表明黄芩苷与汉黄芩苷在肠菌作用下分别代谢为黄芩素与汉黄芩素，不同配伍组中代谢产物增加量有显著差异(苦降组＞黄芩组＞全方组，P＜0.05)，黄芩素降解速率K苦降组＞K黄芩组＞K全方组。由黄芩苷吸收机理可知，半夏泻心汤全方配伍有利于黄芩苷代谢为其苷元黄芩素，促进其吸收。甘草苷与异甘草苷迅速被代谢，降解速率K全方组≈K甘补组＞K甘草组。甘草苷的代谢产物甘草素生成量:全方组＞甘补组＞甘草组。甘草苷的代谢产物甘草素更利于吸收入血。
(2)建立了同时测定半夏泻心汤在肠菌代谢体系中皂苷类8个成分（甘草酸、甘草次酸、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh1)的LC-MS/MS测定方法。由不同配组中各皂苷类成分的肠道菌群的代谢浓度-时间曲线和降解速率，可知甘草酸的降解速率全方组＞甘补组＞单方组，全方组加快甘草酸代谢为甘草次酸，增加甘草次酸入血吸收量。人参皂苷Re的降解速率全方组＞单方组＞甘补组，其代谢产物人参皂苷Rg1后又被代谢降解为人参皂苷Rh1，且降解速率为单方组＞甘补组＞全方组。
(3)对半夏泻心汤全方中黄连有效成分（小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀）进行肠菌代谢研究，结果表明生物碱类成分在肠菌体系中较稳定，与文献报道黄连生物碱类成分主要在肝脏CYP450酶的作用下代谢，无肠菌代谢现象相符。
(4)运用Caco-2细胞模型模拟人肠道上皮细胞，对半夏泻心汤有效单体成分人参皂苷Rb1、黄芩苷、小檗碱、甘草苷及其配伍进行肠道吸收特征研究。MTT细胞毒性结果显示黄芩苷、甘草苷，小檗碱，人参皂苷Rb1的浓度在0～25μg·ml-1均对细胞毒性较小，且各配伍均不会对细胞活性产生影响。黄芩苷和小檗碱可能是由载体介导的主动转运。而甘草苷和人参皂苷Rb1主要吸收机制为被动扩散。黄芩苷、小檗碱的Papp(BL-AP)明显高于相应的Papp(AP-BL)值，存在显著的外流作用，可能黄芩苷是MRP-2的底物，小檗碱为P-gp的底物。当小檗碱与黄芩苷配伍时，由于能量竞争抑制相互的BL-AP的外排作用。甘草苷双侧的渗透系数相当，没有明显的外排现象作用，配伍后减少其BL-AP侧的系数，增加甘草苷的转运吸收。
(5)半夏泻心汤有效组分及其配伍的肠道吸收特征研究结果:MTT细胞毒性结果表明半夏泻心汤全方组、苦降组的非细胞毒性浓度分别为0.002-0.05mg·ml-1，甘补组为0.002-0.25mg·ml-1。在此基础上进行的细胞转运吸收考察显示，全方组配伍可以显著降低黄芩苷Papp(BL-AP)值。可能是全方组其他物质转运吸收耗能，竞争性抑制了其对黄芩苷的外排作用，配伍会影响蛋白转运能力，降低其外排作用，导致黄芩苷吸收增加。与单体转运吸收比较，小檗碱在苦降组、全方组中的AP-BL和BL-AP方向的Papp值都明显减少，说明配伍组中的其它生物碱成分与小檗碱竞争转运，促进小檗碱的转运吸收。由人参皂苷在全方和配伍的表观渗透系数，推测全方配伍不利于人参皂苷Rb1与Rg1的转运吸收。
4.结论：
本文建立了LC-MS/MS方法，用于半夏泻心汤黄酮、生物碱和皂苷三类化合物在Caco-2细胞模型与肠道菌群代谢体系中的含量测定。经过系统的方法学考察，证明方法专属性强，准确可靠、稳定。经肠菌代谢和Caco-2细胞模型吸收研究，表明半夏泻心汤全方配伍促进了黄芩苷、黄芩素、甘草素、异甘草苷、异甘草素、小檗碱及巴马汀等成分的吸收，有利于药效的发挥。有益于探究半夏泻心汤配伍规律及科学内涵和实质。