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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)定植鸡的呼吸道是致病的基础,定植过程需要多种黏附蛋白参与。PvpA是近年来鉴定的粘附有关蛋白,暴露于细胞膜表面,能够被鸡的免疫系统识别,而且还具有种特异性和免疫原性特点,因此在鉴别诊断上具有潜在的应用价值。本课题组前期研究中,分析并揭示了我国分离株与国外分离株、分离株与疫苗株pvpA基因DR-1～DR-2区域间存在独特的分子变异特征。本研究拟以pvpA基因为靶标,建立鸡毒支原体的实时荧光定量PCR检测方法和间接ELISA检测方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病提供新的特异、灵敏的方法。
本研究共分为三个部分:
1.鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到pMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测实验,评价该方法的可行性。结果所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μl,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性实验中,批内和批间变异系数均小于2％,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。
2.pvpA基因的原核表达、纯化及抗体的制备本课题组在前期的研究中分析了pvpA基因的分子特征,通过生物信息学相关软件和在线预测对pvpA基因核酸序列及其编码的氨基酸序列进行分析,选择抗原位点最全面的片段构建表达载体。利用基因重组技术将pvpA基因的PCR扩增产物与原核表达载体pET-41α(+)连接,转化入克隆宿主菌E.coli DH5α。通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导蛋白表达,表达菌液经超声破碎后进行可溶性分析。采用镍亲和层析法纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,三免后采血并分离血清,经Western blotting对表达产物进行鉴定分析。所得纯化蛋白为进一步建立间接ELISA的检测方法奠定了基础。
3.以重组PvpA蛋白为抗原建立检测鸡毒支原体抗体间接ELISA方法的研究本研究以纯化的原核表达PvpA蛋白作为包被抗原,对ELISA反应条件进行优化,确定阴、阳性判定标准,初步建立了检测MG抗体的间接ELISA检测方法。特异性试验结果表明重组PvpA蛋白与鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)阳性血清,滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)阳性血清及大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)“O”抗原阳性血清均不发生交叉反应。重复性试验中,批内变异系数小于8%,批间变异系数小于11%,表明该检测方法具有较好的重现性。采用本研究建立的间接ELISA检测方法和进口试剂盒对不同省份送检的鸡血清进行了检测比较,二者阳性符合率和阴性符合率均达到90%以上。本研究建立的间接ELISA检测方法具有较好的特异性、重复性及准确性,这一研究为MG抗体检测试剂盒的研制奠定了基础,并为MG感染的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。