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植酸酶近年来成为一种新型的绿色饲料添加剂，由于它能把植酸降解为肌醇和无机磷，可以提高饲料的利用率，降低成本，并减少对环境的污染，因而广泛应用于饲料、食品、医药工业以及环境保护。但由于天然植酸酶的热稳定性限制了植酸酶在生产用的应用。解脂耶氏酵母可作为一种优良的表达宿主，它被认为是安全的，能用于食品和药物生产中，并能利用很多普通的碳水化合物和脂肪作为碳源，使其更适合不同的工业应用。本研究通过选用解脂耶氏酵母的表达载体PT14(改造的pINA1296载体)和pINA1297，构建出重组PT14-phyA和pINA1297-phyA解脂耶氏酵母菌株，期望能够得到大量活性高及热稳定性好的重组酶。目前，国内外还没有用PT14和pINA1297表达植酸酶phyA的报道。研究方法和内容如下：
1.植酸酶phyA基因的克隆：利用氯化钠法提取毕赤酵母GS115-phyA总基因组DNA，以其总DNA为模板，根据黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因序列设计出两对引物，通过PCR方法扩增出不含有信号肽和内含子的PT14phyA和1297phyA两种植酸酶phyA片段，其中PT14phyA含有LacO编码基因中的7个碱基，1297phyA片段中含有sfiⅠ和KpnⅠ两个限制性酶切位点。
2.将扩增出的PT1phyA片段与解脂耶氏酵母po1g的表达载体表达载体PT14进行连接，构建出重组表达载体PT14-phyA，PT14-phyA经NotⅠ线性化用电击转化方法转化到解脂耶氏酵母po1g中，利用MD和含有植酸钙的PPB平板初筛出重组解脂耶氏酵母po1g。将筛选出的重组解脂耶氏酵母po1g接入到PPB液体培养基中进行诱导培养，表达的植酸酶酶活第四天时达到最大为22.75U/mL，表达的植酸酶最适pH值较高，经过90℃处理10 min后还有62.47％的残留活性，并且其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。
3.将扩增出的1297phyA片段与解脂耶氏酵母po1h的表达载体表达载体pINA1297进行连接，构建出重组表达载体pINA1297-phyA，pINA1297-phyA经NotⅠ线性化后用醋酸锂转化方法转化到解脂耶氏酵母po1h中，利用YNBcasa和含有植酸钙的PPB平板初筛出重组解脂耶氏酵母po1h。将筛选出的重组解脂耶氏酵母po1h接入到YM液体培养基中进行培养，表达的植酸酶酶活第六天时达到最大为636.23 U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130 kD，但通过去糖基化处理后其分子量变为51 kD，与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5，最适温度为55℃，该酶经过pH2.0-8.0处理1 h后仍有80％酶活，并且90℃处理10 min后还有86.08％的残留酶活，比其它以酵母为宿主菌所表达的植酸酶phyA酶活的热稳定性都高，其用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理2 h后仍有97.08％和88.85％的酶活性。37℃，pH为5.5条件下测得的表达植酸酶对植酸钠的Km值为0.187 mmol/L。