论文部分内容阅读
褪黑素 (melatonin，MLT) 是松果体合成分泌的一种神经内分泌激素。大量研究表明，MLT具有免疫调节作用，它可诱导成人外周血单个核细胞 (peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)的细胞增殖及调节单个核细胞白细胞介素-2(interleukin-21IL-2)、白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、干扰素-γ(interferon-gama，IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等细胞因子的释放，但尚未见MLT调节脐血单个核细胞 (cord blood mononuclear cells，CBMC)活化增殖及细胞因子释放的报道。由于新生儿淋巴细胞“表型"或功能与成人或较大儿童有一定的差异，因此有必要阐明MLT对发育不成熟的新生儿淋巴细胞免疫功能的作用。
目的:
探讨MLT对新生儿CBMC活化增殖及细胞因子释放的调节作用，从而揭示MLT对新生儿淋巴细胞免疫功能的影响。
材料和方法:
取足月顺产健康新生儿脐带血10例，其中男5例，女5例；另取健康成人志愿者外周血10例，其中男5例，女5例，年龄范围20～30岁。经密度梯度离心法分离得到单个核细胞CBMC或PBMC悬液(调节浓度至10<6>/ml)。分设5μg/ml PHA(phytohemagglutinin，植物血凝素)组、50ng/ml、5ng/ml、500pg/ml、50pg/ml MLT组、50ng/ml IL-2组、5ng/ml MLT+5μg/ml PHA及5ng/ml MLT+50ng/ml IL-2组，各取CBMC或PBMC悬液200μl加入96孔板中与上述不同刺激物共培养72h，并设细胞悬液组作空白对照。运用相差显微镜及氚标记胸腺嘧啶核苷(<3>H-thymidine，<3>H-TdR)掺入法观察MLT对CBMC形态学的影响及细胞增殖的调节，并与MLT对PBMC的作用进行比较。另取10例足月顺产健康新生儿的脐带血及10例健康成人志愿者的外周血分离得到单个核细胞CBMC或PBMC悬液(调节浓度至10<6>/ml)，条件同上，分设50ng/ml、5ng/ml、500pg/ml、50pg/ml MLT组及细胞悬液空白对照组，按前述同样方法培养72h，运用细胞因子检测试剂盒及Luminex100液相芯片检测系统检测培养上清中细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、 IL-2、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白细胞介素-10(intefleukin-10，IL-10)、IL-12、IFN-γ及TNF-α的含量，并与MLT对PBMC分泌相关细胞因子的作用进行比较。
结果：
1．CBMC的<3>H-TdR掺入率随培养基中MLT浓度(50pg/ml～5ng/ml)的增加而增加，在5ng/ml效果最显著，当浓度进一步增大至50ng/ml时，CBMC的<3>H-TdR掺入率并未相应增加，反而较5ng/mlMLT组减少。
2．在加入MLT(5ng/ml)的培养基中，经72h培养后，高倍光镜观察下见细胞较培养前明显密集，为较多体积增大的单个核细胞。
3．CBMC培养基中分别加入不同刺激物MLT(5ng/ml)、IL-2(50ng/ml)、MLT+PHA(5μg/ml)、MLT+IL-2，其<3>H-TdR掺入率(cpm)分别为114327±52863、16087±9006、118360±59207和17682±7391，与细胞悬液组(14133±8688)比较，MLT组和MLT+PHA组CBMC的<3>H-TdR掺入率显著增加(t=5.9143，P<0.001；t=5.5078，P<0.001)，IL-2组、MLT+IL-2组CBMC的<3>H-TdR掺入率无明显变化(t=0.4938，P>0.05；t=0.9839，P>0.05)；而MLT组或MLT+PHA组CBMC的<3>H-TdR掺入率与培养基中仅加入PHA组(110397±48663)比较，差异无统计学意义(t=0.1730，P>0.05；t=0.3286，P>0.05)。各种刺激物加入培养基后，CBMC的<3>H-TdR掺入率均明显高于PBMC。
4.MLT可刺激CBMC产生较高水平的IL-2、IL-6、IL-8、IL-12及IFN-γ，与细胞悬液组相比，差异有统计学意义(MLT为500pg/ml时，t=-3.762，P<0.05；F3.016，P<0.05；t=3.642，P<0.05；t=3.867，P<0.05；t=5.805，P<0.05)；不同浓度MLT均可降低CBMC培养上清中TNF-α水平，与细胞悬液组相比，差异均有统计学意义(MLT为50ng/ml时，t=5.441，P<0.05；MLT为5ng/ml时，t=6.957，P<0.05；MLT为500pg/ml时，t=6.633，P<0.05；MLT为50pg/ml时，t=5.420，P<0.05)；但不同浓度MLT对培养上清中IL-1β、IL-4、IL-10含量的影响，与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
5.MLT也可诱导PBMC产生IL-2、IL-12及IFN-γ，抑制TNF-α的分泌，与对照组(PBMC细胞悬液组)比较，差异有统计学意义(MLT为5ng/ml时，t=3.437，P<0.05；t=2.981，P<0.05；t=3.105，P<0.05；t=4.144，P<0.05)；但MLT对PBMC产生IL-6、IL-8的作用，与对照组比较，差异无统计学意义(MLT为5ng/ml时，t=1.069，P>0.05；t=0.992，P>0.05)；对IL-1β、IL-4、IL-10的作用，任一浓度与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
6.比较各自最佳效应浓度的MLT对CBMC(MLT最佳效应浓度为500pg/ml)和PBMC(MLT最佳效应浓度为5ng/ml)释放细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的诱导作用及对TNF-α的抑制作用，除IL-2(t=-1.9330，P>0.05)外，差异均有统计学意义(IL-12：t=3.250，P<0.05；IFN-γ：t=2.546，P<0.05：TNF-α：t=3.097，P<0.05)，且MLT对CBMC分泌细胞因子的调节作用显著强于其对PBMC的作用。
结论：
MLT不但可诱导PBMC活化增殖及调节其细胞因子的释放，也可诱导CBMC的活化增殖及调节其细胞因子的释放，且MLT对CBMC的作用强于PBMC。提示MLT可能参与新生儿淋巴细胞免疫功能的调节，MLT有望作为一种新的免疫治疗剂用于新生儿疾病的治疗。