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癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)的年发病率为10-40/10万,为神经内科中仅次于急性脑血管病的急危重症。约三分之一的病人经过现有两种或三种抗惊厥药物治疗后,癫痫发作仍然难以控制,进展为难治性癫痫持续状态(Refractory status epilepticus,RSE),导致极高的死亡率和致残率,因此,探索新的起效快、作用强的治疗方法,成为神经科临床工作中亟待解决的难点问题。近年来研究发现micro RNAs(mi RNAs)在癫痫病的发生机制中扮演了重要角色。mi RNAs作为一种高度保守的内源性的非编码小分子RNA,长约19-24个核苷酸。能够通过碱基互补配对原则特异性地与一个或多个靶基因的m RNA结合,导致m RNA降解或者翻译抑制,从而在转录后水平负性调控靶基因,参与神经系统的诸多病理生理过程。Mi R-134作为一种特异性的表达于神经系统的mi RNA,主要参与神经元微观结构的调控,如树突棘的密度与长度等,进而调控局部神经回路的兴奋性。既往研究表明,在动物癫痫持续状态发生过程中,海马mi R-134表达出现了明显的上调。结合其特异性的表达与生理功能,我们假设:mi R-134可能参与了癫痫持续状态的发生,对其深入研究可能为癫痫持续状态的治疗提供一个新的靶点。目的探讨mi R-134在癫痫持续状态发生中的作用以及机制。方法(1)构建大鼠mi R-134抑制慢病毒载体并验证;(2)应用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立大鼠癫痫持续状态模型,从在体角度观察mi R-134抑制对大鼠发作潜伏期,癫痫持续状态时间,发作严重程度,脑电图功率以及海马神经元凋亡的影响;(3)应用无镁细胞外液诱导原代培养神经元持续放电,建立离体癫痫持续状态模型,观察mi R-134抑制对神经元放电频率及神经保护作用的影响;(4)从离体水平研究mi R-134抑制对无镁离体癫痫持续状态模型中神经元树突棘密度的影响;结果(1)将一段362bp的包含2个mi R-134竞争结合位点的DNA片段经Xho I和Eco RI酶切后插入质粒p CDH-CMV-MCS-EG(R)FP-MCS中EGFP序列的下游,该片段转录产物与mi R-134互补形成稳定的复合物,从而阻止了mi R-134对靶m RNA的降解或翻译抑制。得到大鼠mi R-134抑制病毒载体,转染293T细胞及神经元72小时后经荧光显微镜观察可见80%左右的细胞有绿色荧光蛋白表达,q RT-PCR检测可见病毒组较对照组mi R-134表达明显降低,说明抑制mi R-134慢病毒包装成功;(2)立体定向注射mi R-134抑制慢病毒于大鼠海马并放置海马电极,2周后建立氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态模型,进行急性期脑电图监测,结果提示mi R-134抑制慢病毒组较相应对照病毒组Ⅴ级发作潜伏期延长(P<0.01),脑电图总功率降低(P<0.001),癫痫持续状态时间缩短(P<0.05)。癫痫持续状态后3天制备脑片进行免疫荧光染色,结果提示mi R-134抑制慢病毒组海马DG、CA1及CA3区较相应对照病毒组Neu N阳性细胞数增多,Tunel阳性细胞减少;(3)无镁离体SE样发作模型制备后72小时,mi R-134表达升高(P<0.05)。Mi R-134抑制慢病毒预处理组经无镁细胞外液处理后SE样放电频率较对照病毒组明显降低(P<0.001);活细胞数较对照病毒组增多(P<0.001);(4)同对照病毒组相比,mi R-134抑制慢病毒预处理组经无镁细胞外液处理后(离体癫痫持续状态模型)神经元树突棘密度减少(P<0.05);结论(1)抑制大鼠海马mi R-134,能够减轻癫痫持续状态发作并具有神经保护作用;(2)抑制大鼠海马神经元mi R-134,能够降低离体无镁癫痫持续状态模型的放电频率,并具有神经保护作用;(3)Mi R-134可能在树突棘重塑过程中扮演重要角色;