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成纤维细胞是广泛分布于体内的间质细胞，人牙髓成纤维细胞（Human DentalPulp Fibroblasts，HDPF）作为牙髓中的主体细胞，传统的观念认为其主要负责合成细胞外基质，近来研究发现HDPF在牙髓免疫和炎症中发挥重要的作用，可能成为未来牙髓炎症抗炎治疗的潜在靶点。Nemosis是新近报道发生在成纤维细胞的一种细胞激活和死亡形式。J Bizik等学者最早发现正常的成纤维细胞如果诱使其形成“球状”集落，其非但不生长，反而经历一种被称为“nemosis”的细胞激活途径[1]。发生nemosis的成纤维细胞首先形成“球状”聚集，随后产生促炎性，蛋白水解和生长因子应答，于此同时开始自发性分解，此过程具有程序性细胞坏死的特征[2-4]。已报道nemosis能发生于包括新生儿包皮成纤维细胞，新生儿和成人皮肤成纤维细胞等，但牙髓组织的主体细胞HDPF能否发生nemosis，至今少有研究[2,4]。Nemosis可用来研究成纤维细胞的激活以及成纤维细胞与周围细胞之间关系，是一种重要的实验模型[2]。迄今，nemosis作用的靶细胞包括癌细胞，上皮细胞，内皮细胞和免疫细胞，nemosis作用的靶细胞是否包括干细胞以及之间的相互作用，国内外未见有报道。为此本实验通过三维培养HDPF构建nemosis模型，探讨HDPF发生nemosis的特诊，并在此基础上运用nemosis模型，研究HDPF发生nemosis对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）细胞迁移的影响，为干细胞修复炎症损伤牙髓提供实验基础。1、三维培养HDPF形成球状聚集的研究成纤维细胞激活nemosis途径起始于在U形96孔板板底预先用琼脂铺板后三维培养成纤维细胞，这种三维培养体系鲜明的形态学特征就是形成肉眼可见的球状细胞聚集体。在第一部分实验，我们通过反复摸索实验条件，三维培养HDPF构建HDPF形成球状细胞聚集体，在此基础上分别用CCK8实验和LDH实验进行了三维培养的HDPF和普通HDPF细胞代谢和胞膜损伤的研究，结果表明随着培养时间的延长，三维培养的HDPF细胞活力受到影响，活细胞数逐渐减少，细胞胞膜损伤程度逐渐加重，扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察了三维培养聚集成团的HDPF随着培养时间的延长，逐渐发生细胞膜穿孔破损，球体内细胞线粒体肿胀，内质网扩张，细胞内空泡形成，染色质边集，核固缩，核溶解和核碎裂等符合细胞坏死的形态学特征，此部分结果提示三维培养的HDPF可形成球状聚集，随着培养时间的延长逐渐发生细胞坏死。2、三维培养HDPF发生nemosis释放炎性因子和趋化因子的研究发生nemosis的成纤维细胞球能分泌大量炎性因子和趋化因子，其中一个特征是诱导环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表达和释放白介素-8（Interleukin-8，IL-8）。COX-2是诱导花生四烯酸转变为前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的酶，既往研究指出炎症牙髓较正常牙髓组织COX-2表达增高，因此我们选择研究COX-2，PGE2和IL-8作为研究HDPF发生nemosis释放炎症因子和趋化因子的指标。第二部分的实验结果发现三维培养的HDPF随着培养时间的延长，炎症因子COX-2蛋白表达逐渐增高，释放PGE2逐渐增多，同时趋化因子IL-8的释放逐渐增多，球体聚集后此过程不可逆转，而普通贴壁培养的HDPF在培养期间上述因子未见明显表达。值得注意的是在我们的三维培养体系中，不存在外界毒力因子，COX-2，PGE2和IL-8的高表达仅仅是由于HDPF细胞和细胞之间球状聚集发生nemosis引起的，提示HDPF发生nemosis释放炎症因子和趋化因子是程序性的。3、三维培养HDPF发生nemosis对人牙髓干细胞（hDPSCs）迁移的影响长期以来牙髓炎症被认为不利于牙髓损伤修复，然而最近的研究提示炎症反应可能与牙髓损伤修复中干细胞的激活有关。I.About等学者指出牙本质-牙髓复合体损伤修复的研究不仅需要研究干细胞潜力，也需要研究牙髓中支持细和干细胞之间的相互作用。本研究第二部分研究结果表明HDPF发生nemosis可释放一系列炎症因子和趋化因子，提示我们可以利用nemosis模型研究HDPF和hDPSCs之间的相互作用。因此，本研究的第三部分运用transwell细胞迁移实验探讨三维培养HDPF发生nemosis对hDPSCs细胞迁移的影响，发现三维培养HDPF条件培养液较普通贴壁培养HDPF能诱导数量更多的hDPSCs发生细胞迁移，这一结果首次揭示了nemosis对干细胞的影响，关于HDPF发生nemosis的研究可能为运用干细胞促进牙髓炎症损伤修复打下实验基础以及提供新的思路。