论文部分内容阅读
研究目的应用人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESC)来源的视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium, RPE)进行体内细胞移植治疗,为视网膜变性疾病患者重见光明带来了希望。然而hESC向RPE细胞诱导分化效率低、成熟周期长、造价高仍然是目前研究的瓶颈。RPE由神经外胚层发育而来,促进hESC向神经外胚层分化,可以提高RPE定向诱导效率。文献报道,转化生长因子-β(TGF-p)超家族受体抑制剂Compound C能提高hESC向神经方向诱导分化效率,抑伟hESC向内胚层、中胚层及滋养外胚层分化。本研究通过在诱导分化培养体系中加入Compound C,观察其对RPE诱导效率的影响,并对hESC来源的RPE (hESC-RPE)细胞特性进行体外验证,为将来hESC来源的RPE移植治疗视网膜变性疾病提供基础。方法将H1hESC分为对照组和Compound C处理组。对照组在细胞过度融合后,以去除碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血清替代物(KOSR)培养体系诱导RPE定向分化；Compound C处理组于诱导分化前6d在培养体系中加入1uMCompound C。在诱导分化第1、3、5周,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组人类配对盒基因(PAX6)、小眼球相关转录因子(MITF)、细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)、RPE65mRNA的表达。将hESC-RPE细胞分离纯化,采用RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot)、细胞免疫荧光法和吞噬实验对纯化的hESC-RPE细胞进行体外鉴定。结果1、在诱导分化第4周,Compound C处理组肉眼可见黑色素团块出现,而对照组无色素团块出现。诱导分化第5周,Compound C处理组可见多个色素细胞团,对照组刚开始出现色素团块。2、RT-PCR检测结果显示,Compound C处理组PAX6mRNA表达在诱导分化第1、3周显著高于对照组,差异有统计学意义(t=28.498、3.141,P<0.05)。诱导分化第3、5周,Compound C处理组MITF(t=8.866、10.111). CRALBP(t=5.293、5.394)和RPE65(t=9.263、9.504)的表达均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3、将Compound C处理组的色素细胞分离纯化后,显微镜下可见所培养的细胞均为多角形细胞形态,细胞质充满色素颗粒。4、RT-PCR检测结果显示,hESC-RPE细胞分别与hESC、ARPE19细胞相比,PAX6、MITF、CRALBP、RPE65表达均显著增高,差异有统计学意义(PAX6: t=9.154,7.605, P<0.05; MITF:t=l7.284,16.770, P<0.05; CRALBP:t=18.204,18.190, P<0.05; RPE65:t=44.194, t=44.190, P<0.05)。5、Western blot检测结果显示,hESC-RPE细胞高水平表达RPE标志蛋白PAX6、 MITF、CRALBP、RPE65。6、细胞免疫荧光检测结果显示hESC-RPE细胞能表达RPE细胞特异性标志蛋白PAX6、MITF、CRALBP、RPE65、ZO-1。7、吞噬实验显示,hESC-RPE细胞能吞噬聚苯乙烯荧光微球,具有吞噬功能。结论TGF-β受体抑制剂Compound C能显著提高hESC向RPE细胞定向诱导效率。hESC-RPE细胞具备RPE典型的多角形、色素化外观,能高表达RPE标志基因和蛋白,具有吞噬功能。hESC-RPE细胞表达RPE标志基因和标志蛋白显著好于ARPE19细胞系,更加适合细胞移植治疗视网膜变性疾病,为视网膜变性疾病的研究提供了更好的细胞平台。