番茄中一个抗病基因的遗传转化及抗病性的初步研究

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番茄抗病基因中含有卷曲螺旋结构(coiled-coil,CC)、核苷酸结合位点(Nucleotide binding site, NBS)和富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich repeat, LRR)结构域是植物中最大类抗病家族之一,其中多数的R基因都具有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域。CC-NBS-LRR结构是R基因重要的结构,对植物的抗病起到很重要的作用。青枯病、早疫病、晚疫病、枯萎病、叶霉病等病害为番茄生产带来了毁灭性的的影响,同时外界不良的环境以及各种病原菌通常会给植物生长发育造成一定侵害,植物在长期的进化过程中已经形成了完善的自我保护机制以抵御病原菌入侵以及外界不良环境的伤害。研究表明植物抗病R基因能够识别病原体引发过敏性反应(Hypersensitive response, HR),从而提高植物病害的防御能力。本研究中通过酵母双杂筛选获得了DDB1IP9基因,与番茄中重要DDB1基因蛋白具有相互作用,并通过Sol Genomics Network和NCBI (National Center for Biotechnology Information Search database)进行信息比对,含有CC-NBS-LRR结构,预测具有R基因抗病性,从而用番茄中过表达转基因方式进一步探究。分子克隆中通过强启动子CaMV 35S具有很好的表达效果,将DDB1IP9构建到pB1121::35S载体上,获得pBI121::DDB1IP9重组载体,构建了DDB1IP9过表达载体并通过根瘤农杆菌介导转化到野生型番茄中,进行筛选获得DDB1IP9高表达的阳性过表达番茄株系。并通过构建烟草过表达载体PBTEX::DDB1IP9-Flag,进行瞬时表达。进行抗病实验实验中,对转基因T1代阳性DDB1IP9转基因番茄幼苗和野生型番茄AC接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst.DC3000),进行表观观察比较番茄植株病发情况和平板划线计算比较1cm2同位置叶片的菌落数差异,通过病菌接种实验比较,初步分析可以发现番茄DDB1IP9的抗病功能。本研究结果表明,DDB1IP9转基因植株的发病情况明显少于野生型AC,野生型植株的发病情况比较严重;打孔取样1cm2菌落数发现野生型AC的菌落数是DDB1IP9转基因的2-4倍,说明DDB1IP9转基因对Pst. DC3000具有明显高于野生型番茄抵抗作用,具有比较明显的抗病性。过表达DDB1IP9基因能够提高番茄对Pst.DC3000的抵抗性,提高番茄抗病性,对番茄的种植带了很好经济价值。为采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的尝试,同时DDB1IP9又与番茄DDB1蛋白具有相互作用,对研究DDB1的功能途径研究提供新的方向。
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