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乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种小的双链、嗜肝DNA病毒,具有高度的种属和组织特异性,只感染人和类人猿。目前应用较多的HBV感染细胞模型有如下三类:(1)整合HBV全基因组至肝癌细胞,其可表达HBV复制中间产物,并分泌HBV颗粒,应用最广泛的为HepG2.2.15细胞系;(2)利用肝癌细胞瞬时转染携带HBV全基因组的质粒;(3)利用腺病毒系统导入HBV基因组;(4)利用杆状病毒导入HBV基因组。但HBV在上述细胞模型中的复制过程均非HBV自然感染过程,不能体现HBV生命周期各方面,特别是病毒特殊的细胞受体及进入细胞核的机制。人类或树鼩肝细胞培养可直接感染HBV颗粒,但其缺点是来源和制备困难,感染效率也较低,维持时间短。法国学者Gripon等建立的肝癌细胞系HepaRG,可以被含HBV的血清直接感染,但感染前细胞需在一定条件下诱导分化,且病毒复制水平太低,感染能力尚不稳定。因此,目前缺乏高效HBV易感细胞模型。确立一种自然易感乙肝病毒的细胞系对乙肝病毒的研究及慢性乙肝的治疗非常重要。本研究通过用表达杀稻瘟菌素(Bsd)抗性的重组HBV颗粒感染多种肝癌细胞,经杀稻瘟菌素多轮筛选,提供了一个维持HBV自然感染和复制的细胞模型。并利用这一细胞模型,观察了拉米夫定的抗病毒作用。目的:筛选一个可维持HBV感染与复制的细胞模型方法:取肝癌患者的癌组织,经分离培养并连续传代后,有15例获得了较好生长状态的细胞,连同本实验室的HepG2、Huh7、QSG-7701、SMMC-7721细胞系,感染表达Bsd抗性基因的重组HBV-Bsd颗粒,应用Bsd筛选抗性克隆。经筛选前后比较,确定一株有前景的细胞,继续进行8轮筛选(S1-S8),每轮筛选均留存细胞备用。将QSG-7701-S0至QSG-7701-S8多代细胞感染HBV携带者血清,通过ELISA、荧光定量PCR检测细胞培养上清液中HBs Ag、HBV DNA含量,并提取细胞裂解液Southern Blot检测HBV DNA,以证明经过多轮筛选后,细胞对HBV的感染性增强。为进一步研究最终确定的HBV易感细胞系的特性,感染HBV后,通过Southern Blot,观察其对HBV感染剂量的依赖性;通过感染表达荧光蛋白的重组HBV-hr GFP颗粒,观察GFP的表达;并在感染后不同时间,经Southern Blot、Northern Blot和ELISA检测病毒复制中间体、HBV RNA及培养液中HBs Ag变化;利用这一细胞模型,通过Southern观察拉米夫定的抗病毒作用。结果:取筛选后获得的S1(selection 1)细胞与相应的S0细胞,感染高滴度HBV携带者血清,8天后取细胞培养上清液,应用化学发光法定量检测HBs Ag,发现QSG-7701细胞对HBV的易感性基础水平最高,后续试验以此细胞株继续传代培养,并连续8轮筛选,分别命名为S1-S8。取S0、S1、S3、S5、S7、S8细胞,感染高滴度HBV携带者血清,用化学发光法检测细胞培养上清液,发现HBs Ag有明显升高趋势,S8细胞上清中HBs Ag含量达15.8ng/ml。应用荧光定量PCR检测了上清液中HBV DNA,也提示有明显升高趋势。收集细胞裂解液,提取HBV DNA,经Southern Blot检测,发现HBV复制能力逐渐增强。HBV复制中间体在S8中有相对较高水平表达。在QSG-7701-S8细胞中,分别加入不同剂量的HBV感染者血清,应用化学发光法检测细胞培养上清液中HBs Ag,发现其与感染的病毒量呈明显剂量依赖性。利用重组HBV颗粒HBV-hr GFP,感染QSG-7701-S0、QSG-7701-S8细胞系,在荧光显微镜下发现QSG-7701-S8对HBV的易感性明显增加。QSG-7701-S8感染HBV感染者血清后不同时间点,分别收集细胞裂解液,提取细胞内总DNA,行Southern Blot检测,于感染6天可见少量复制中间体,9和12天可见HBV DNA量明显增加,并可见ccc DNA形成。提取细胞内总RNA,行Northern Blot检测,证实在感染后6天起,检测到HBV RNA的表达,并随时间不断增加。应用化学发光法检测,发现细胞培养上清液中HBs Ag自5天开始升高,8-10天达高峰(16 ng/ml),随后逐步下降。通过Southern Blot检测,发现DMSO可强化HBV复制。行体外抗病毒实验,并经Southern Blot证实,拉米夫定可抑制HBV复制并呈剂量依赖性。结论:本实验结果表明,QSG-7701细胞可自然感染HBV,并能维持病毒复制,经Bsd筛选,感染效率及复制能力明显提高。本实验提供了一个可以自然HBV感染与复制的细胞模型,可为HBV分子生物学研究及筛选抗HBV药物提供帮助。