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第一部分Melatonin抑制缺氧状态下人脐静脉内皮细胞的迁移及HIF-1α的表达目的:探讨Melatonin对缺氧状态下HUVECs迁移及HIF-1α表达的影响。方法:1、HUVECs分别予常氧状态、缺氧、缺氧加melatonin处理,以细胞划痕实验及实验检测HUVECs迁移率。2、HUVECs在缺氧和常氧条件下培养,以免疫印迹法检测HIF-1α的表达;经melatonin干预后,HUVECs暴露于缺氧状态后以免疫印迹法检测HIF-1α的表达;3、HUVECs转染HIF-1αsi RNA后在缺氧状态下培养,以细胞划痕实验检测HUVECs迁移率。结果:1,缺氧状态下HUVECs的迁移较常氧状态增加,melatonin作用后可使HUVECs迁移下降,melatonin的作用与剂量成正比。2,缺氧后HIF-1α表达增加,HIF-1α被si RNA干扰后HUVECs迁移受到抑制。Melatonin通过抑制缺氧后HIF-1α的表达而使HUVECs迁移受到抑制。结论:Melatonin可抑制缺氧诱导的HUVECs迁移,其作用呈剂量依赖性;melatonin抑制缺氧后HIF-1α的表达进而抑制HUVECs迁移。第二部分Rac1参与Melatonin抑制缺氧诱导HUVECs迁移的机制研究目的:探讨Rac1参与Melatonin抑制缺氧诱导HUVECs迁移的机制。方法:1,HUVECs在缺氧及常氧状态培养后以GST-pulldown实验检测Rac1活性;2,HUVECs转染Rac1-V12或空载体质粒(对照组)后予以melatonin干预,以GST-pulldown实验检测Rac1活性,以免疫印迹法检测HIF-1α的表达,以细胞划痕实验检测HUVECs迁移率。3,HUVECs转染Rac1-T17N或空载体质粒(对照组),以细胞划痕实验检测缺氧状态下HUVECs迁移情况。4,以细胞免疫荧光染色检测缺氧状态下Rac1的定位。5,以免疫印迹法检测细胞溶菌产物ERK磷酸化程度;HUVECs经ERK抑制剂U0126干预后以细胞划痕实验检测HUVECs迁移率。结果:1,Melatonin抑制缺氧状态下HUVECs中HIF-1α的表达,该过程需要Rac1参与。2,Melatonin对缺氧诱导的HUVECs细胞迁移的抑制作用与其阻断Rac1活化有关。3,缺氧可促进Rac1从细胞浆中(可溶部分)转移到细胞骨架(不溶部分),而且这种现象可被melatonin逆转。4,ERK激活是Rac1活化的上游途径之一,melatonin抑制缺氧诱导的Rac1活化及HUVECs迁移与其阻断ERK的磷酸化有关。结论:Melatonin抑制缺氧状态下HUVECs中HIF-1α的表达,该过程需要Rac1参与。ERK激活是Rac1活化的上游途径,melatonin抑制对低氧诱导的Rac1活化及HUVEC迁移与其阻断ERK的磷酸化有关。