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研究背景动脉粥样硬化是指脂肪和纤维物质在动脉最内层（内膜）的积累。动脉粥样硬化一词来源于希腊语,反映了典型动脉粥样硬化斑块（或动脉粥样硬化）核心的脂质物质的外观。随着时间的推移,动脉粥样硬化斑块会变得纤维化,并因积累钙质而钙化。严重的动脉粥样硬化斑块可侵犯动脉管腔,阻碍血液流动,导致组织缺血。动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）已是世界范围内血管疾病的主要原因。当它影响心脏自身的循环时,就会导致急性冠状动脉综合征包括心肌梗死或稳定性心绞痛（心肌灌注不足引起的胸痛或不适）等。对于粥样硬化的发病机制,在过去的20-30年里,许多研究证明了动脉粥样硬化和多种危险因素密切相关,如吸烟、肥胖、衰老、炎症、糖尿病和血流动力学障碍。虽然越来越多的关键调控因素被发现可以治疗和缓解动脉粥样硬化,但全球动脉粥样硬化的发病率仍然很高。因此,努力研究出尽可能多的病理机制并找出更多有效的治疗靶点已成为动脉粥样硬化领域相关研究的当务之急。因此,为了在中国汉族人群中找到一个对冠状动脉疾病（CAD）具有显著易感性的新基因,我们对来自山东研究中心的200个“患病个体”作为北方人群进行了全基因组关联研究,并从上海中心（293 CAD/293个对照）纳入为南方人群,其中发现NPRC的6个SNP（rs700926、rs1833529、rs2270915、rs17541471、rs3792758 和 rs696831）与中国北方和南方人群的 CAD相关,另外两个SNP为在中国中部人群中患有CAD。然而,NPRC基因多态性与CAD之间关联的分子机制尚不清楚。利钠肽（NPs）家族包括心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）和C型利钠肽（CNP）以及它们的三种受体（NPRA、NPRB、NPRC）组成。NPs具有共同的结构和功能特性。继1981年,de Bold发现心房提取物有利钠作用之后,ANP、BNP及CNP的蛋白序列相继被被报道出来。随后,大量的研究证实了 NPs对多个系统的多种生理作用。例如,心脏中分泌的NPs可以调节动脉血管的舒张功能从而降低动脉血压。血液中的NPs可以调节脂肪组织的代谢和纤维化。CNP可以通过受体影响骨骼的生长和发育等等。而NPs的受体中,对NPRA和NPRB的研究最多也最广泛。之前人们普遍认为,NPs发挥作用主要通过与NPRA或者NPRB的结合,而NPRC仅仅是NPs的清除受体,通过内吞作用和溶酶体降解来中和它们的生理功能使系统能够保持稳态。而且对于三种受体,NPs的亲和力也有较大差别。对于NPRA,钠尿肽家族亲和力的排列顺序是ANP＞BNP＞＞CNP。对于NPRB,顺序是 CNP＞＞ANP＞BNP。有趣的是,NPRC 与 ANP、BNP 和 CNP具有相似的亲和力。换句话说,ANP和BNP是最倾向于与NPRA结合的,而NPRB则是CNP最偏爱的配体。然而,近些年越来越多的研究质疑了这一说法,他们发现与作为鸟苷酸环化酶受体的NPRA和NPRB不同,NPRC虽然没有鸟苷酸环化酶活性,但具有抑制性鸟嘌呤核苷酸调节蛋白（Gi）的活性。有一项研究表明,CNP可以通过和NPRC的结合来维持包括动脉粥样硬化在内的血管稳态。与此相反,也有一些人认为CNP和NPRC的结合可能通过在分子水平上激活Gi、ERK1/2和磷酸肌醇3-激酶γ/Akt来诱导血管新生。无论如何,这些证据都提示了 NPRC除了作为NPs的清除受体外,其本身也有潜在的信号通路并和心血管疾病密切相关。然而,却很少有研究报道NPRC的缺失在动脉粥样硬化中的作用。动脉粥样硬化的发生发展涉及了多种病理过程和分子机制,在本研究中,我们提出以下科学假说:在高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中,NPRC的缺失可以减轻动脉粥样硬化斑块中的炎症反应和细胞凋亡,从而改善动脉粥样硬化的病变程度。研究目的1.探讨NPRC与小鼠动脉粥样硬化病理发生的相关性;2.探讨NPRC是否参与调节小鼠动脉粥样硬化斑块的病变程度;3.探讨NPRC是否参与调节小鼠粥样硬化斑块中的内皮细胞凋亡;4.探讨NPRC是否参与调节小鼠粥样硬化斑块中的炎症反应。研究方法1.实验动物利用CRISPR-Cas9技术在C57BL/6背景小鼠上构建NPRC基因敲除（NPRC-/-）小鼠。并与载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠杂交扩繁后,得到同窝纯合ApoE-/-小鼠和纯合ApoE-/-NPRC-/-小鼠。ApoE-/-小鼠购买于北京唯尚立德生物科技有限公司（中国北京）。2.实验动物分组（1）选取8周龄的雄性ApoE-/-小鼠20只,随机分为两组,每组10只:普食喂养组,高脂喂养组。（2）分别选取8周龄雄性ApoE-/-小鼠和同窝雄性ApoE-/-NPRC-/-小鼠,随机分成两组,每组 25 只:ApoE-/-组,ApoE-/-NPRC-/-组。3.动脉粥样硬化小鼠模型的建立8周龄的雄性ApoE-/-小鼠和同窝雄性ApoE-/-NPRC-/-小鼠,全程给予高脂饮食（0.2%胆固醇,21%乳脂）喂养,并保证水源充足。期间每天观察小鼠状态,12周后给予小鼠安乐死,并留取小鼠血液、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪组织及主动脉组织标本进行后续实验。4.小鼠基因型鉴定利用鼠尾DNA提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,在PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。此外,提取小鼠的主动脉组织蛋白,利用蛋白质免疫印迹分析（Western blot）的方法检测NPRC的蛋白表达水平,评估NPRC的基因敲除效率。5.体重和体长称量应用电子天平（Shimadzu Corp）称量ApoE-/-小鼠和ApoE-/-NPRC-/-小鼠的体重,每只小鼠测量3次,取其平均值作为体重的最终数值。应用30厘米刻度尺测量ApoE-/-小鼠和ApoE-/-NPRC-/-小鼠的体长,每只小鼠测量3次,取其平均值作为体长的最终数值。6.鼠尾血压和心率测定应用无创小动物鼠尾血压计测量ApoE-/-小鼠和ApoE-/-NPRC-/-小鼠的血压和心率,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠连续测量3次,取其平均值作为最终数值。7.组织取材动物实验结束时,给予小鼠安乐死后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,转-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以待后续实验使用。8.血脂水平检测留取体内实验第二部分中ApoE-/和ApoE-/-NPRC-/-组小鼠血清,检测ApoE-/-和ApoE-/-NPRC-/-组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇的水平。9.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取出冻存在-80℃冰箱中的ApoE-/-组和ApoE-/-NPRC-/-组小鼠血清,应用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNFα、IL-6、MCP1、ICAM1和VCAM1的含量。10.血管组织中cAMP水平检测使用CyclicAMPXP化学发光检测试剂盒测量主动脉组织中的cAMP水平,并在酶标仪上测量和读取数值。11.血清中利钠肽水平的检测留取ApoE-/-组和ApoE-/-NPRC-/-组小鼠血清,利用ELISA的方法检测ApoE-/-组和 ApoE-/-NPRC-/-组小鼠血清中心房利钠肽（Atrial natriuretic peptide,ANP）、脑利钠肽（Brain natriuretic peptide,BNP）以及 C 型利钠肽（C-type natriuretic peptide,CNP）水平的差异。12.血管组织全基因组测序分析高脂饮食喂养12周的ApoE-/-小鼠5只,ApoE-/-NPRC-/-小鼠5只,取出其主动脉组织,加入RNA later后放入液氮速冻,送至杭州联川生物科技有限公司（中国杭州）进行RNA测序。13.组织标本病理学检测对主动脉行大体油红O染色。主动脉根部制备连续冰冻切片,主要进行H＆E染色、油红O染色、饱和苦味酸-天狼猩红染色。对NPRC、α-SMA、MOMA2、TNFα、IL-6、MCP1、ICAM1、VCAM1、PPARγ和PGC1α 等指标进行免疫组织化学染色,对NPRC进行组织免疫荧光染色。14.细胞培养和处理实验中采用人原代脐静脉内皮细胞（HUVEC）,培养在含5%胎牛血清（FBS）及1%内皮细胞生长因子（ECGF）的基础培养基中。Raw264.7巨噬细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中。所有细胞均于含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）根据oxLDL浓度梯度预实验,100mg/mL oxLDL刺激HUVEC 12或24小时,所表达的TNFα、IL-6、MCP1的水平都较高;100mg/mLoxLDL刺激HUVEC 0.5小时或1小时,所表达的通路蛋白磷酸化水平都较高;因此接下来的细胞实验选用oxLDL 100mg/mL刺激12和24小时作为检测蛋白表达的实验条件、刺激0.5和1小时作为检测蛋白磷酸化的实验条件。（2）HUVEC实验组加入100mg/mL oxLDL,对照组加入等体积的1XPBS,刺激12和24小时后,收集细胞;（3）HUVEC实验组加入100mg/mL oxLDL,对照组加入等体积的1XPBS,刺激0.5和1小时后,收集细胞;（4）HUVEC实验组加入100mg/mL oxLDL,对照组加入等体积的1XPBS,刺激24小时后,收集细胞上清;加入预先种好板的巨噬细胞中,刺激12小时,收集细胞;15.蛋白免疫印迹实验利用蛋白提取试剂盒提取小鼠主动脉组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HUVEC细胞总蛋白,首先进行BCA蛋白浓度测定,之后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测 NPRC、TNFα、IL-6、MCP1、ICAM1、VCAM1、PPARγ、PGC1α、p-CREB、CREB、p-VASP、VASP、eNOS、p-PKA substrates、p-AKT1、AKT1、caspase3、cleaved-caspase3、caspase7、cleaved-caspase7、p-Iκκα/β、Iκκα、Iκκβ、p-P65和P65的蛋白含量。16.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取ApoE-/-组和ApoE-/-NPRC-/-组小鼠主动脉组织RNA以及细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过实时荧光定量 PCR 获得目的基因 TNFα、IL-6、MCP1、PPARγ、PGC1α 和 eNOS 的 Ct值,以β-actin为内参基因,将所得的Ct值,代入公式（2-ΔΔCT）计算目的基因表达量的相对水平。17.细胞转染体外培养HUVEC,将NPRC的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减基因NPRC的表达。18.腹腔巨噬细胞的提取选取8-10周雄性野生型（C57BL/6）小鼠,每只小鼠提前3天给予腹腔注射1mL无菌3%肉汤;小鼠脱颈处死后,充分暴露腹膜;用无菌注射器吸取30mL无血清DMEM灌洗腹腔3次,直至DMEM变得澄清,收集细胞悬液。在1,000 rpm离心5分钟后,将细胞用新鲜的完全培养基重新悬浮并培养用于后续实验。19.巨噬细胞迁移实验将HUVEC给予1 00mg/mL oxLDL刺激24小时后收集其上清;通过Transwell小室细胞迁移实验,检测Raw264.7细胞和腹腔巨噬细胞在oxLDL刺激后的HUVEC上清作用下的迁移能力。20.巨噬细胞脂质吞噬实验将HUVEC给予100mg/mL oxLDL刺激24小时后收集其上清;将上清加入到预先种好板的巨噬细胞爬片中,并且给予100mg/mL oxLDL刺激36小时,于4%多聚甲醛固定后,对巨噬细胞爬片进行油红O染色。21.TUNEL细胞凋亡检测给予HUVEC 100mg/mL oxLDL刺激24小时后,使用TUNEL试剂盒检测HUVEC的凋亡水平。22.数据统计分析方法所有数据均使用GraphPad Prism 8软件进行分析。首先采用Shapiro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。采用非配对t检验分析属于正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,而多组间的统计差异则采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,在验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,则使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在高脂高胆固醇饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型主动脉组织中NPRC的表达量明显上调我们通过应用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠12周成功构建了动脉粥样硬化小鼠模型。通过Western blot和组织免疫荧光染色的方法检测发现与普通饮食喂养12周的ApoE-/-小鼠对比,高脂饮食喂养组ApoE-/-小鼠主动脉组织中的NPRC表达量明显上调。2.利用ApoE-/-NPRC-/-小鼠构建高脂高胆固醇饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用CRISPR-Cas9技术成功构建NPRC敲基因（NPRC-/-）小鼠。再用NPRC-/-小鼠和ApoE-/-小鼠杂交得到ApoE-/-NPRC-/-小鼠和同窝对照的ApoE-/-小鼠。通过对小鼠鼠尾基因组DNA进行基因型的测序鉴定,证实了 ApoE-/-NPRC-/-小鼠成功构建。同时利用Western blot和组织免疫化学染色的方法进一步验证ApoE-/-NPRC-/-小鼠主动脉组织中NPRC的蛋白敲除效率。（2）测量2组小鼠（ApoE-/-组和ApoE-/-NPRC-/-组）造模后的体重和体长,发现NPRC基因敲除不影响小鼠的体重,但明显增加小鼠的体长。3.NPRC基因缺失下调高脂高胆固醇小鼠血清甘油三酯的水平结果显示造模后的ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的血清甘油三酯水平明显低于造模后的ApoE-/-组小鼠。4.NPRC基因缺失不影响高脂高胆固醇小鼠血清胆固醇的变化高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平无明显差异。5.NPRC基因缺失轻微降低高脂高胆固醇小鼠收缩压的水平高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的收缩压有轻微的降低。6.NPRC基因缺失不影响高脂高胆固醇小鼠心率、舒张压和平均动脉压的水平高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的心率、舒张压和平均动脉压的水平未见明显差异。7.NPRC基因缺失减轻高脂饮食诱导的动脉粥样硬化病变程度大体油红O染色结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的主动脉斑块负荷,明显低于ApoE-/-组小鼠。H＆E染色观察斑块形态,发现与ApoE-/-组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的主动脉斑块横断面积明显下降。以上说明NPRC基因缺失明显减轻了动脉粥样硬化小鼠的病变程度。8.NPRC基因缺失影响了动脉粥样硬化斑块中的组织成分组织病理学染色结果显示,与ApoE-/-组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoE-/-NPRC-/-组小鼠斑块内脂质及巨噬细胞的含量百分比明显下降,而斑块内平滑肌细胞和胶原的含量百分比却明显增加。因此,与ApoE-/-组小鼠相比,由公式计算出的ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的斑块易损指数也相应下降。提示NPRC基因缺失影响了动脉粥样硬化斑块中的组织成分并且增加了斑块的稳定性。9.基因测序分析NPRC基因缺失对动脉粥样硬化小鼠主动脉组织mRNA表达谱的影响全转录组测序结果发现,两组间的差异基因明显富集在炎症反应、白细胞募集和浸润中。10.NPRC基因缺失减轻血清及斑块中的炎症相关分子和黏附分子的水平利用MSD多因子检测结果显示,造模后,ApoE-/-NPRC-/-组小鼠血清中TNFα、IL-6、MCP1、ICAM1 和 VCAM1 的浓度明显下降。同时 IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测2组小鼠主动脉组织,结果同样提示与ApoE-/-小鼠对比,NPRC基因敲除后明显降低小鼠主动脉组织中的炎症相关分子TNFα、IL-6、MCP1和黏附分子ICAM1和VCAM1的表达。11.在主动脉壁的三种细胞中内皮细胞的NPRC mRNA表达量最高RT-PCR结果显示,NPRC mRNA的表达水平高低顺序依次为血管内皮细胞,血管平滑肌细胞和巨噬细胞。提示在NPRC基因缺失调节动脉粥样硬化病变的机制中,可能是以内皮细胞作为主要的作用靶点。12.NPRC基因敲减上调斑块中和HUVEC中的eNOS表达水平利用Western blot和RT-PCR的检测方法,我们发现高脂高胆固醇饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE-/-NPRC-/-组小鼠斑块内eNOS的表达量明显上调。此外,体外的细胞实验也同样证明了在HUVEC中敲减NPRC能够挽救oxLDL刺激所造成的eNOS表达下调。13.NPRC基因敲减减轻oxLDL诱导的HUVEC凋亡利用TUNEL细胞凋亡检测发现,在HUVEC中敲减NPRC能够减少oxLDL刺激所诱导的HUVEC凋亡细胞数。此外,Western blot结果显示,在oxLDL刺激24小时后,与阴性对照组相比,NPRC干扰组HUVEC中凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase7 明显减少。14.NPRC基因敲减减轻oxLDL刺激引起HUVEC的p-AKT1水平下调结果显示,oxLDL刺激HUVEC造成了 AKT1的磷酸化水平下降,而在HUVEC中敲减NPRC后,AKT1的磷酸化水平下降得到明显缓解。15.NPRC基因敲减减轻oxLDL刺激HUVEC炎症相关分子和黏附分子的表达RT-PCR、Western blot及MSD多因子检测结果显示,在oxLDL刺激下,HUVEC敲减NPRC基因后炎症相关分子TNFα、IL-6、MCP1的mRNA、蛋白合成和分泌水平都明显低于阴性对照组。此外,Western blot实验同样证实了与阴性对照组相比,敲减NPRC基因后的HUVEC在oxLDL刺激后表达的黏附分子ICAM1及VCAM1明显下调。16.在oxLDL刺激下,HUVEC中敲减NPRC基因后对巨噬细胞迁移的影响Transwell巨噬细胞迁移实验结果显示,在oxLDL刺激24小时后,与阴性对照组相比,NPRC干扰组HUVEC的培养基上清诱导巨噬细胞的迁移能力明显下降。17.在oxLDL刺激下,HUVEC中敲减NPRC基因后对巨噬细胞吞噬脂质的影响巨噬细胞油红O染色结果显示,在oxLDL刺激24小时后,与阴性对照组相比,NPRC干扰组HUVEC的培养基上清能够有效抑制巨噬细胞对脂质的吞噬,进而减少泡沫细胞的形成。18.在oxLDL刺激下,HUVEC中敲减NPRC基因后对巨噬细胞炎症相关分子表达的影响RT-PCR结果显示,在oxLDL刺激24小时后,与阴性对照组相比,NPRC干扰组HUVEC的培养基上清能够有效抑制巨噬细胞中炎症相关分子TNFα、IL-6、MCP1 的表达。19.在oxLDL刺激下,HUVEC敲减NPRC基因抑制NF-κB信号通路的激活Western blot结果显示,oxLDL刺激HUVEC明显活化了 NF-κB信号通路,而在HUVEC中敲减NPRC明显抑制了 Iκκα/β和P65的磷酸化水平。通过以上结果可知,NPRC敲减可能通过抑制NF-κB信号通路从而抑制oxLDL诱导的HUVEC的炎症反应。20.NPRC基因缺失或敲减均激活cAMP/PKA信号通路两组小鼠的主动脉组织的cAMP水平结果显示,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE-/-NPRC-/-组小鼠主动脉组织中的cAMP明显上调,继而增强了ApoE-/-NPRC-/-组小鼠主动脉组织中的PKA磷酸化水平。此外,在体外的敲减HUVEC中的NPRC的实验中,我们也观察到了同样的增强的PKA磷酸化水平。以上结果说明NPRC基因缺失或敲减均激活cAMP/PKA信号通路。21.PKA通路激活上调HUVEC中eNOS和P-AKT1的表达并抑制NF-κB信号通路结果显示,PKA激动剂明显上调HUVEC的eNOS表达和AKT1的磷酸化水平,而PKA的抑制剂则明显抑制了这一效应。加入PKA激动剂的HUVEC中P65的磷酸化水平被抑制,而PKA抑制剂反而激活了 HUVEC中的P65的磷酸化。22.NPRC基因缺失减轻AS病变程度的机制通过以上体内和体外实验,我们可以基本了解NPRC基因缺失减轻AS病变程度的机制:NPRC基因缺失激活了内皮细胞的cAMP/PKA通路,增强内皮细胞的eNOS的表达,抑制内皮细胞的凋亡和炎症,从而降低了斑块内的巨噬细胞的炎性浸润和脂质吞噬,最终减轻了 AS的病变程度。实验结论1.NPRC在发生粥样硬化斑块的主动脉病理组织中蛋白表达量升高。2.NPRC基因缺失明显减轻了小鼠粥样硬化病变程度。3.NPRC基因缺失缓解了粥样硬化斑块中内皮细胞的凋亡。4.NPRC基因缺失减少了粥样硬化小鼠体内的炎症。研究背景动脉粥样硬化作为一种慢性炎症相关疾病,以内皮功能障碍、炎症细胞募集、脂质氧化和形成细胞形成为特征。肥胖是动脉粥样硬化的主要危险因素。脂肪组织发挥能量代谢、储存和释放脂质的作用,与动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉疾病等各种心血管疾病的发生过程密切相关。在饮食诱导的肥胖中,脂肪组织以炎症和功能失调为特征,释放更多的促炎脂肪细胞因子和游离脂肪酸,导致血管炎症和氧化应激,以系统性方式增强动脉粥样硬化。进一步了解脂肪组织与动脉粥样硬化之间的关系可能为保护肥胖患者免受动脉粥样硬化风险提供新的知识和措施。脂肪组织遍布全身,主要由脂肪细胞组成。脂肪细胞根据性质的不同,大致可分为三种表型（白色、米色和棕色）。此外,脂肪细胞的表型并不是固定不变的,它们可以在不同的条件下相互转化。白色脂肪组织（White adipose tissue,WAT）是最丰富的脂肪组织类型。病理状态下,白色脂肪细胞除释放脂肪酸外,还能分泌大量促炎因子,促使巨噬细胞等多种免疫细胞进入脂肪组织。因此,白色脂肪组织逐渐导致全身炎症,这可能在动脉粥样硬化的进展中发挥作用。据报道,与WAT相比,棕色脂肪组织（BAT）可以缓解小鼠的高甘油三酯和防止动脉粥样硬化的发展。利钠肽可调节利尿、利钠、血管舒张和血管重塑等多种生理过程,其中包括心肌细胞产生的心房和脑利钠肽（ANP和BNP）以及内皮释放的C型利钠肽（CNP）。此外,还发现了三种主要的利钠肽受体,即利钠肽受体A（NPRA）、利钠肽受体B（NPRB）、利钠肽受体C(NPRChNPRC在几年前仅仅被认为是ANP、BNP和CNP的清除受体,但由于其未被发现的功能,如抑制性鸟嘌呤核苷酸调节蛋白（Gi）的活性等,越来越受到研究者的关注。有一项研宄表明,脂肪特异性缺失的NPRC增强了白色脂肪组织的棕色化,并防止了饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。此外,CNP与维持血管稳态相关。然而,很少有研宄报道NPRC在伴有动脉粥样硬化的脂肪炎症中发挥作用。因此,为了明确NPRC对脂肪炎症伴动脉粥样硬化的作用,我们通过制备NPRCaAPoE-z-/-小鼠构建动脉粥样硬化模型,并与ApoE-M、鼠进行比较,探索脂肪表型、代谢和炎症反应,不仅揭示了NPRC在脂肪炎症反应中的作用,但也可能为预防动脉粥样硬化提供新的观点。研究目的1.探讨NPRC与高脂血症小鼠脂肪炎症发生的相关性;2.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪炎症的病变程度;3.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪中巨噬细胞的浸润;4.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪细胞的凋亡;5.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪中的氧化应激。研究方法1实验动物分组⑴选取8周龄的雄性ApoE-/-小鼠10只,随机分为两组,每组5只:普食喂养组,高脂喂养组。⑵分别选取8周龄雄性ApoE-A小鼠和同窝雄性ApoEv-NPRC-a小鼠,随机分成两组,每组5只:ApoE-A组,ApoE-z-NPRC-z-组。2.高脂血症小鼠模型的建立8周龄的雄性ApoEv-小鼠和同窝雄性ApoE-A NPRC—小鼠,全程给予高脂高胆固醇（0.2%胆固醇,21%乳脂）喂养,并保证水源充足。期间每天观察小鼠状态,12周后给予小鼠安乐死,并留取小鼠血液、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪组织及主动脉组织标本进行后续实验。3.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠脂肪组织,分别放于液氮保存或者放于脂肪组织专用固定液中固定24-48h以待后续实验使用。4.小鼠脂肪组织制备将固定在脂肪组织专用固定液中的小鼠脂肪组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。5.免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色利用IHC染色的方法检测普食组ApoE-z-小鼠和高脂组ApoE-z-小鼠白色脂肪组织中的Mac2的蛋白表达水平;检测高脂喂养的ApaE-/-组小鼠和ApoE-/-NPRC-a组小鼠的白色脂肪组织中的NPRC、Ucpl、Mac2、IL-lp、Nlrp3的蛋白表达水平。利用免疫组织荧光染色检测ApoEi组小鼠和ApoE^NPRC-/-组小鼠的白色脂肪组织中的脂联素的蛋白表达水平。6.TUNEL细胞凋亡检测利用TUNEL试剂盒检测ApoEA组小鼠和ApoE-/-NPRC-z-组小鼠的白色脂肪组织中的细胞凋亡水平。7.组织DHE荧光染色利用DHE荧光染色试剂盒检测ApoE-/-组小鼠和ApoE-/-NPRC-Z-组小鼠的白色脂肪组织中的活性氧自由基水平。8.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-timePCR,RT-PCR）提取高脂喂养的ApoE-/-小鼠和ApoE-A NPRC-M、鼠的脂肪组织RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因MCP1、TNFa、IL-6和IL-lp的Ct值,利用p-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-aact公式计算目的分子的相对表达量的变化。9.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取高脂喂养的ApoEv-小鼠和ApoE+NPRC-z-小鼠的脂肪组织蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。10.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表不为均数（mean）±标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中NPRC的表达量明显上调我们通过应用高脂饮食喂养ApoE-z-小鼠12周成功构建了高脂血症小鼠模型。通过Western blot的方法检测发现与普通饮食喂养12周的ApoE/小鼠对比,高脂饮食喂养组ApoE-/-小鼠脂肪组织中的NPRC表达量明显上调。2.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中巨噬细胞浸润明显增加通过免疫组织化学的方法检测发现与普通饮食喂养12周的ApoE-/-小鼠对比,脂饮食喂养组7-小鼠脂肪组织中的巨噬细胞浸润明显增加3.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中凋亡细胞数明显增加通过TUNEL细胞凋亡检测的方法检测发现与普通饮食喂养12周的ApoE+小鼠对比,高脂饮食喂养组ApoE-/-小鼠脂肪组织中的凋亡细胞数明显增加。4.在髙脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中氧化应撖明显增强通过DHE荧光染色的方法检测发现与普通饮食喂养12周的ApoE-/-小鼠对比,高脂饮食喂养组APoE-/-小鼠脂肪组织中的氧化应激明显增强。5.利用ApoE-z-NPRC"小鼠构建髙脂诱导的高脂血症小鼠模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用CRISPR-Cas9技术成功构建NPRC敲基因（NPRG7-）小鼠。再用小鼠和ApoE-A小鼠杂交得到Apo^-NPRG7-小鼠和同窝对照的ApoE4小鼠。通过对小鼠鼠尾基因组DNA进行基因型的测序鉴定,证实了ApoE+NPRCA小鼠成功构建。同时利用Western blot和组织免疫化学染色的方法进一步验证了ApoE^NPRC-/-小鼠脂肪组织中NPRC的蛋白敲除效率。⑵测量2组小鼠（ApoE-A组和ApoE—NPRC7-组）造模后的体重,发现NPRC基因敲除不影响小鼠的体重。6.NPRC基因缺失下调高脂髙胆固醇小鼠血清甘油三酯的水平结果显示造模后的ApoE-ANPRC7-组小鼠的血清甘油三酯水平明显低于造模后的ApoE/-组小鼠。7.NPRC基因缺失不影响高脂髙胆固醇小鼠血清胆固醇的变化高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE-z-NPRC-z-/-组小鼠的血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平无明显差异。8.NPRC基因缺失轻微降低髙脂髙胆固醇小鼠收缩压的水平高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE+NPRC-z-组小鼠的收缩压有轻微的降低。9.NPRC基因缺失不影响髙脂髙胆固醉小鼠心率、舒张压和平均动脉压的水平高脂饮食喂养12周后,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE+NPRC-/-组小鼠的心率、舒张压和平均动脉压的水平未见明显差异。10.NPRC基因缺失下调ApoE+小鼠白色脂肪的体积和重置结果显示,与ApoEv组小鼠相比,髙脂饮食喂养12周的ApoE+NPRC-/-组小鼠的白色脂肪的体积和重量明显下调。白色脂肪组织的H＆E染色结果显示,与ApoE-/-组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoE+NPRC7-组小鼠的白色脂肪细胞直径显著下降11.NPRC基因缺失不影响APoEM、鼠棕色脂肪的体积和重置结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoE+NPRC-/-组小鼠和ApoE-/-组小鼠的棕色脂肪的体积和重量之间没有明显差异。棕色脂肪组织的H＆E染色结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoE+NPRC-/-组小鼠和ApoE-/-组小鼠的棕色脂肪细胞直径没有显著差异。12.NPRC基因缺失减轻ApoE A小鼠白色脂肪中的炎症相关因子的表达RT-PCR结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoEvNPRC-/-组小鼠白色脂肪中TNFot、MCP1、IL-6的表达明显少于ApoE-/-组小鼠。13.NPRC基因缺失减轻ApoE-z-小鼠白色脂肪中的巨噬细胞浸润结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoE+NPRC-/-组小鼠白色脂肪中的巨噬细胞浸润,明显低于ApoE-/-组小鼠。14.NPRC基因缺失减轻了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的细胞凋亡利用TUNEL细胞凋亡检测发现,与ApoE—组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoEiNPRC-/-组小鼠白色脂肪中凋亡细胞数显著降低。15.NPRC基因缺失减轻了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的氧化应激DHE荧光染色结果显示,与ApoE7-组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoE^NPRC-z-组小鼠白色脂肪中活性氧水平明显下调。11.NPRC基因缺失下调了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的Nlrp3炎症小体和IL-邛的表达免疫组织化学染色结果显示,与Apo-/-组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoEvNPRCA组小鼠白色脂肪中的NLRP3炎症小体和IL-1P表达下调。12.NPRC基因缺失促进了ApoE"-小鼠白色脂肪的棕色化Western blot和免疫组织化学染色结果显示,与ApoE7-组小鼠相比,高脂饮食喂养12周的ApoEANPRCA组小鼠白色脂肪中的脂肪棕色化marker分子Ucpl的表达显著上调。13.NPRC基因缺失促进了ApoE-/-小鼠白色脂肪的脂解作用结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoE+NPRC-/-组小鼠白色脂肪中的Atgl、Hsl、Lpl和Mgl的蛋白表达水平明显高于ApoE-/-组小鼠。14.NPRC基因缺失上调了ApoE+小鼠白色脂肪中的脂联素水平结果显示,高脂饮食喂养12周的ApoE-/-PRC7-组小鼠白色脂肪中脂联素水平明显高于ApoE+组小鼠。15.NPRC基因缺失撖活PKA信号通路两组小鼠的Western blot结果显示,与ApoE-/-组小鼠相比,ApoE^NPRC7-组小鼠白色脂肪中的PKA磷酸化水平显著上调。此外,在APoEaNPRC-/-组小鼠白色脂肪中,PKA通路的下游靶蛋白PPARy和PGCla的表达水平同样显著高于APoE-/-组小鼠。以上结果说明NPRC基因缺失或敲减激活cAMP/PKA信号通路。16.NPRC基因缺失减轻商脂血症小鼠脂肪炎症的机制通过以上实验,我们可以基本了解NPRC基因缺失减轻高脂血症小鼠脂肪炎症的机制:NPRC基因缺失激活了脂肪细胞中的PKA通路,增强白色脂肪的棕色化和脂解作用,上调白色脂肪的脂联素的表达,抑制炎症相关分子的表达,从而下调巨噬细胞的炎症浸润,细胞凋亡和氧自由基的产生,最终减轻了白色脂肪的炎症。实验结论1.NPRC参与了调控高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠的白色脂肪炎症;2.NPRC缺失通过激活脂肪细胞中的PKA通路,增强白色脂肪的棕色化和脂解作用,上调白色脂肪的脂联素的表达,抑制炎症相关分子的表达,从而下调巨噬细胞的炎症浸润,细胞凋亡和氧自由基的产生,最终减轻了白色脂肪的炎症。