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犬乳腺肿瘤与人类乳腺癌有很多相似之处。人和犬的乳腺癌都是中老年时期最常发的肿瘤性疾病之一，常见的肿瘤生物学类型也相同，治疗方法也相似，因此，研究犬乳腺肿瘤对人类乳腺肿瘤的发病原因、致病机理、药物试验、临床预防和治疗以及预后的准确判断等具有重要的指导作用。用犬乳腺肿瘤作为模型进行基础实验和临床研究对人类和犬都具有很重要的意义。虽然近十几年对犬乳腺肿瘤的研究报道逐渐增多，但方法还缺乏多样性，光动力学疗法是近年来引进肿瘤治疗的的新方法之一。研究HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡机制，目的是探求HMME-PDT抗肿瘤的作用靶点及分子机理，为光学动力疗法在肿瘤性疾病治疗中的应用提供理论依据。
本实验选用自然发生乳腺肿瘤病例的转移灶分离培养的乳腺肿瘤细胞系CHMm，用HMME联合He-Ne激光进行体外作用。采用荧光显微镜检测HMME在细胞内的分布及CHMm对HMME吸收和达到饱和的时间；用不同剂量的光敏剂和氦-氖激光进行正交实验，采用MTT法检测细胞存活率，摸索HMME-PDT对犬乳腺肿瘤细胞体外杀伤作用的最佳参数；通过苔盼蓝实验和细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶活性的检测，确定HMME-PDT对犬乳腺肿瘤细胞的体外杀伤效应，并用Hoechst33258法检测细胞凋亡情况；采用分光光度法检测线粒体内SOD、GSH-Px活性和MDA含量变化：通过流式细胞仪检测线粒体膜电位和线粒体通透性转运孔的变化，偶氮砷Ⅲ分光光度法检测线粒体Ca2+转运能力的变化；用荧光探针标记细胞胞浆中的Ca2+含量变化，用甲基香酚蓝比色法检测线粒体Ca2+含量变化。采用分光光度法检测HMME-PDT犬乳腺肿瘤细胞内Caspase-3、8、9的活性变化。用实时荧光定量PCR检测P53、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平；利用Western Blot方法检测分别检测胞浆蛋白中Bax、Bcl-2、Cyto C蛋白的表达。
实验结果表明：光镜下观察CHMm细胞培养后细胞贴壁状况良好，细胞生长增殖旺盛，折光性好。在培养2～4d内细胞处于对数生长期，此阶段细胞适合进行实验研究。HMME经过紫外荧光激发，发出红色荧光，HMME主要分布在细胞质中，细胞核周围区域荧光较强，光敏剂分布较多。HMME被犬乳腺肿瘤细胞吸收后，呈现绿色荧光，根据荧光强度判定犬乳腺肿瘤细胞CHMm在90 min内对HMME吸收达到饱和。经HMME-PDT剂量筛选实验发现，单独光敏剂和单独激光照射对细胞影响较小，HMME剂量20μg·ml-1联合光照剂量为2.8J·cm-2时，具有很好的杀伤效应。苔盼蓝染色实验和乳酸脱氢酶活性检测共同验证了HMME-PDT对犬乳腺肿瘤的杀伤效应，处理后细胞在12～48h之间死亡率较高，与对照组相比差异显著(P＜0.05)。Hoechst33258荧光染色实验发现，实验组细胞出现凋亡现象，发出强蓝色荧光，细胞核浓染，固缩，出现致密浓染的颗粒，明亮程度具有时间依赖性。犬乳腺肿瘤细胞经HMME-PDT处理后，线粒体内SOD、GSH-Px活性呈现下降趋势，SOD活性在3～12h时间段与对照组相比差异极显著(P＜0.01)；GSH-Px活性在6～48h时与对照组相比差异极显著(P＜0.01)；线粒体内MDA含量呈上升趋势，实验组与对照组相比，MDA含量均高于对照组，并且差异极显著(P＜0.01)。SOD、GSH-Px、MDA变化具有时间依赖性。流式细胞仪检测线粒体膜电位降低，PTP开放，并随时间延长变化增强。实验组Ca2+摄取能力逐渐降低，实验组间相比在4～12min内差异极显著(P＜0.01)。HMME-PDT使细胞内游离Ca2+浓度增加，实验组间相比差异极显著(P＜0.01)。细胞线粒体内Ca2+浓度在处理3h后，实验组与对照组相比均呈极显著差异(P＜0.01)。HMME-PDT使犬乳腺肿瘤细胞胞浆中Cyto C蛋白含量随处理后时间延长而增加。HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞中Caspase-3、8、9的激活，表现极强的时间依赖性。HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞P53、Bax mRNA表达增高，并在6～48 h与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。Bcl-2 mRNA表达降低，0～12 h与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。HMME-PDT使犬乳腺肿瘤细胞胞浆Bax蛋白水平增高，Bcl-2蛋白水平降低，Bcl-2/Bax随时间增加而减小。
通过本实验得出以下结论：HMME在犬乳腺肿瘤细胞系中主要分布在细胞质中，在细胞核周围分布较多。犬乳腺肿瘤细胞对HMME饱和吸收时间小于2h。HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞发生凋亡，随处理后时间延长杀伤效应增加。作用强度与光敏剂和激光剂量有关，激光剂量为2.8J/cm2，光敏剂为20μg/mL时，HMME-PDT作用效果最好。用HMME-PDT处理犬乳腺肿瘤细胞后，细胞线粒体内SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高，引起氧化还原失衡，自由基产生增多，导致凋亡；细胞线粒体膜电位降低，线粒体膜通透性转换孔开放，线粒体Ca2+转运能力下降；胞浆内Ca2+浓度随时间延长而升高，线粒体内Ca2+浓度先升高后降低；细胞内Caspase-3、8、9活性随作用后时间的延长而升高；HMME-PDT能诱导犬乳腺肿瘤细胞上调P53、Bax mRNA表达，下调Bcl-2 mRNA表达；细胞胞浆中Cyto C含量增加，Bcl-2蛋白水平随时间延长降低，Bax蛋白水平随时间延长升高。