【摘 要】
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紫杉醇是一种四环二萜酰胺类化合物,1992年底被美国FDA认证作为抗癌药物上市.它的作用机理在于能促进微管聚合抑制其降解,从而抑制细胞有丝分裂,使细胞分裂阻滞在G2/M期.它广
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紫杉醇是一种四环二萜酰胺类化合物,1992年底被美国FDA认证作为抗癌药物上市.它的作用机理在于能促进微管聚合抑制其降解,从而抑制细胞有丝分裂,使细胞分裂阻滞在G2/M期.它广泛存在于红豆杉科红豆杉属植物中,但含量较低,并常与无抗癌活性的紫杉烷类似物相伴而生,因此,研究紫杉醇的合成代谢机理并提高其产量已成为当前许多科研工作者的迫切需要.差异显示反转录聚合酶链式反应,简称DDRT-PCR.因其操作简单、快速、灵敏性高、易重复等优点,自1992年由Liang Peng和Dr.Pardee发明以来,已成为分子生物学领域一种强有力的工具,被广泛地用来分离差异表达的基因.在实验中,我们采用了mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和银染技术相结合,对用MJ(200μ M)处理不同时间而诱导表达的基因进行分离,共得到差异表达的cDNA片段69条.方法是:用MJ(200μ M)分别处理悬浮细胞6h、16h、24h,用未经处理的做对照,提取的总RNA经反转录后进行PCR扩增,扩增的PCR产物最后经6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染显色后可观察到清晰的条带.差异显示的PCR产物条带绝大部分在150个碱基对到750个碱基对之间.所回收的69条差异带,经Reverse Northern.验证后,得到阳性表达的cDNA片段10个,其中包括7个"上调"基因和3个"下调"基因.对这10个阳性cDNA片段克隆并测序,通过与GeneBank中的EST数据库比对,结果发现,4个与已知序列有较高的同源性,其中w-10与已发表的中国红豆杉紫杉二烯合成酶(taxadiene synthase)序列同源性高达93％,该基因是受MJ诱导表达增强的,在诱导6小时后表达量就有明显提高,这与预计结果相符,要了解该基因的功能并实现对其调控,就必须首先得到全长基因序列,然后可将其置于强组成型启动子控制之下,极有希望提高转化细胞株合成紫杉醇的能力,这方面仍需大量深入细致的工作.除此以外,我们还得到3个片段与某些植物基因序列有较高的同源性,但与紫杉醇生物合成无相关性,还有6个片段在比对中没有发现同源性很高的基因,推测可能为未知蛋白,其具体功能有待进一步研究.
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