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研究背景：气道粘液高分泌(airway mucushypersecretion)是慢性气道炎症性疾病的重要病理生理特征之一,也是目前呼吸系统疾病亟待解决的主要问题之一。由于目前粘液高分泌相关性疾病的普遍性和危重性,人们逐渐开始关注MUC,即粘蛋白。目前,已发现了21种粘蛋白,其中至少有12种在气道中表达。在病理状态下,气道粘蛋白的改变主要表现为由杯状细胞分泌的MUC5AC增加。许多粘液高分泌疾病,如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管扩张、囊性纤维化(CF)等疾病的病理生理改变与MUC5AC的表达升高密切相关,所以研究粘蛋白MUC5AC表达的调控机制尤为重要。 AGR2(human anterior gradient-2,HAG-2或Gob-4),是蛋白质二硫键异构酶家族(PDIs)的成员之一,是一个在人组织中广泛表达但功能尚不清楚的小分子分泌型蛋白。MUC2是肠道粘液的主要成分,动物实验研究发现AGR2与肠道粘液合成密切相关,其对肠道粘液产生是必不可少的。MUC5AC是气道粘液中最主要的组成部分,我们设想AGR2与气道粘液分泌也存在密切关系,所以我们采用NIC-H292细胞,给予CMV-Sport6-AGR2质粒转染细胞,检测气道粘蛋白MUC5AC mRNA及蛋白的表达情况,探讨AGR2对人气道上皮MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白表达的影响。 研究目的:观察CMV-Sport6-AGR2质粒转染人气道粘液上皮NCI-H292细胞后AGR2mRNA和MUC5ACmRNA的表达情况,同时检测粘蛋白MUC5AC的表达,探讨AGR2对人气道上皮MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白表达的影响。 研究方法：体外培养人气道粘液上皮癌细胞系NCI-H292细胞,予以不同浓度的CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞24h后,采用免疫细胞化学方法检测不同浓度的CMV-Sport6-AGR2质粒转染情况,即AGR2蛋白表达情况。选择最佳浓度的CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞,设为转染组,没有用CMV-Sport6-AGR2质粒转染的NCI-H292细胞设为对照组。采用逆转录-聚合酶链式反应(PT-PCR)技术检测两组细胞AGR2 mRNA和MUC5AC mRNA的表达情况;免疫细胞化学SP染色法观察两组细胞MUC5AC蛋白的表达情况。 研究结果： 1.CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞的最佳浓度为1.33μg/ml,设此浓度的CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞为转染组。 2.CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞后AGR2mRNA和MUC5ACmRNA表达水平的变化: 2.1 RT-PCR结果显示,CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞后AGR2mRNA表达阳性(0.61±0.05),而对照组未出现AGR2 mRNA的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。 2.2 RT-PCR结果显示,CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞后MUC5ACmRNA表达量(0.85±0.09)较对照组(0.35±0.04)明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01)。 3.CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞后MUC5AC蛋白水平变化:免疫细胞化学结果发现,MUC5AC蛋白阳性信号定位在细胞浆中,细胞的胞浆染色呈黄色或黄褐色;对照组仅有少数细胞胞浆着色, CMV-Sport6-AGR2质粒转染NCI-H292细胞后MUC5AC染色明显增强呈阳性。转染组阳性细胞百分率(21.2±5)与对照组(2.6±0.4)相比有明显差异,差异具有统计学意义(P<0.01)。 结论：AGR2可诱导人气道上皮细胞系NCI-H292细胞MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白过度表达,在气道粘液高分泌中起重要作用。