面向于致病微生物多元检测及基因分型的纸基显色传感新技术研究

来源 :华南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kobe7751790
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近年来,随着各国贸易往来的日趋频繁,使得食源性致病菌在全球范围内大面积传播,给人类的生存健康与发展带来了巨大的威胁。因此为了保证食品的安全,快速的、高特异性且高灵敏地检测食品致病菌方法已经成为科学研究的热点话题。目前食源性致病菌的检测方法有很多,主要是培养分离法和标准的生化方法。这些方法存在很多限制其应用的局限性。基于纸基的核酸诊断平台是一种快速的诊断方法,在临床诊断、食品质量控制和环境监测中有很广泛的应用。它可以在10-15min内定量或者半定量的检测出核酸或者抗体。与其它的技术方法相比,这种方法更方便,快捷,灵敏度高且容易携带,已经广泛应用于免疫检测和药物分析中。  在本研究中,我们开发了一种基于共用引物介导的多元非对称PCR扩增和生物显色传感器对食品致病菌进行多元检测和基因分型。在共用引物介导的多元非对称PCR中,我们设计了一条共用引物来避免在多元检测中严格的参数优化实验。利用这种新型的多元扩增方法,扩增出的单链产物不需要预杂交或者变性,可以直接利用于接下来的纸基基因传感器的诊断。且在致病菌的多元检测中,只需要一种探针标记的纳米金便可同时对单增李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌进行特异性的检测。整个纸基基因传感器的检测步骤在恒温下进行且在10-15min内可得到肉眼可见的检测信号。这种方法的灵敏度是1pg/μL。这种方法极大地简化了PCR扩增与纸基基因传感器结合检测的实验步骤。该方法不仅可以用于食品致病菌的多元检测,还可以用于细菌的基因分型检测。  为了更好地实验现场的快速诊断,我们提出了一个滚环扩增结合纸基显色传感新技术的检测平台。通过滚环扩增对单增李斯特菌的hlyAmRNA进行高效特异性扩增,扩增后的单链产物经过Hhal酶进行特异位点酶切后,形成与锁式探针长度相同的片段。将酶切后的单链产物不经过预变性杂交,可直接进行试纸条检测。在优化的实验条件下,可以检测到100fg/μL总RNA。整个过程实验包括连接,扩增,酶切,检测等反应均可在恒温条件下进行,且可在几个小时内完成。这种方法适用于快速的现场检测,此外,这项研究强调了纸基显色诊断平台的潜在价值和应用前景。
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