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我国水禽养殖规模不断扩大,其中鸭饲养量平均每年以10%-15%的速度递增,鹅饲养量约占世界养鹅数量的70%以上。随着水禽养殖集约化程度的提高,水禽的传染性疫病如禽流感、鹅副粘病毒病、鸭瘟、小鹅瘟、鸭病毒性肝炎（Ⅰ型）、番鸭细小病毒病、禽霍乱等对水禽养殖业产生重要危害。本研究针对生产上水禽常发的重要疫病鸭瘟（Duck plague,DP）、小鹅瘟（Gosling plague,GP）、鹅副粘病毒病（GooseParamyxovirosis,GPMVS）和番鸭细小病毒病（Muscovy duckling parvovirosis,MDPVS）进行了多重PCR与基因芯片检测技术研究。主要研究内容如下:1水禽重要疫病的三种多重PCR检测技术研究1)GPV和DPV多重PCR方法的建立根据GenBank上已公布的鹅细小病毒（GPV）和鸭瘟病毒（DPV）基因序列,分别设计合成了针对GPV VP3基因和DPV UL6基因的两对特异性引物,以人工接种鸭胚尿囊液和人工感染病例组织的核酸提取物为模板,采用PerfectshotTM Ex Taq进行PCR检测。试验结果显示,所建立的多重PCR反应体系对GPV与DPV核酸提取物均能扩增出与预期设计大小一致（分别为550 bp和376 bp）的特异DNA条带,而对鹅副黏病毒、鸭肝炎病毒、鸭源沙门氏菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌均为阴性反应;对GPV核酸的最小检出量为1.66 pg,对DPV核酸为0.166 Pg;对20份人工感染雏鹅肝脏组织中GPV与DPV单独或混合感染的检出率均为100%。表明建立的GPV-DPV多重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和DPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。2)GPV和GPMV多重PCR检测方法的建立根据GenBank上公布的鹅副粘病毒（GPMV）和鹅细小病毒（GPV）基因序列,分别设计合成了针对GPMV HN基因和GPV NS基因的两对特异性引物,以GPMV/GPV人工感染鹅胚尿囊液和感染病例组织的核酸提取物为模板,进行RT-PCR检测。建立的多重RT-PCR反应体系对GPMV和GPV核酸提取物均能扩增出与预期设计大小一致（分别为484 bp和206 bp）的特异DNA条带,而对DPV、鸭肝炎病毒、鸭源沙门氏菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌均为阴性反应;对GPMV和GPV核酸的最小检出量分别为86 pg和0.176 pg;对GPV单独感染病例的检出率为100%（5/5）,GPMV单独感染病例的检出率为100%（5/5）;混合感染病例的检出率GPV为100%（10/10）,GPMV为80%（8/10）。表明建立的GPMV-GPV多重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPMV或/和GPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。3) GPV和MDPV多重PCR检测方法的建立根据GenBank上公布的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）基因序列,分别设计合成了针对GPV NS基因和MDPV NS-VP1基因的两对特异性引物,以GPV感染鹅胚尿囊液和MDPV感染番鸭胚尿囊液的核酸提取物作为模板,分别进行单独或多重PCR检测。所设计的PCR体系对GPV和MDPV核酸均能扩增出与预期设计大小一致（730 bp和624 bp）的特异DNA条带,而对鸭瘟病毒（DPV）和鹅副粘病毒（GPMV）均为阴性反应;单一PCR核酸检测的灵敏度是GPV 0.144 pg,MDPV 28.8 pg,而多重（二联）PCR检测灵敏度是GPV 14.4 pg和MDPV 28.8 pg。表明建立的GPV-MDPV复合PCR方法可用于其鉴别诊断和联合检测。2 DPV-GPV-GPMV检测基因芯片的构建与检测技术研究1)DPV-GPV-GPMV检测基因芯片靶基因克隆及鉴定通过对DPV、GPV和GPMV进行基因比较分析后,采用Array Designer4.2软件分别设计DPV、GPV和GPMV引物,以PCR或RT-PCR扩增获得13个靶基因片段,并进行了克隆和测序分析,结果获得了T/DPV DNApolymeras、T/DPV UL50、T/DPVTK、T/DPV UL6、T/DPV phosphoprotein、T/GPV NS、T/GPV VP3、T/GPV VP1-VP2、T/GPV VP2-VP3、T/GPMV HN、T/GPMV L、T/GPMV F和T/GPMV NP等13个靶基因,多重序列比对和BLASTN分析进一步表明:针对DPV靶基因的同源性在88%以上,GPV靶基因的同源性在92%以上,GPMV靶基因的同源性在92%以上,为DPV-GPV-GPMV检测基因芯片构建提供了确实可靠的材料。2)DPV-GPV-GPMV检测基因芯片的构建以所获得的13个靶基因,构建了DPV-GPV-GPMV检测基因芯片,并对芯片质量进行了评价。每张芯片含有特异靶基因、阳性参照、空白对照等15个靶基因,每个靶基因重复点10次,样点直径100μm,间距300μm;靶基因终浓度为250 ng/μL点制在氨基化基片上,紫外线交联固定,制备好的芯片经过42℃预杂交2 h之后,以Cy3标记探针杂交16 h,经梯度洗涤后,532 nm波长扫描采集杂交信号;GenePix Pro 6.0软件进行数据分析,芯片检测阳性判读标准为信噪比SNRm≥2.0（信号总强度中位值模式量化）。结果表明,所制芯片上的靶基因间无交叉杂交,芯片特异性强,片间差异小。3)DPV-GPV-GPMV检测基因芯片检测技术研究多重PCR扩增标记探针,采用引物组合Ⅰ（GPV NS、DPV DNApolymerase和GPMVF）、引物组合Ⅱ（DPV UL50、DPV UL6和GPMV HN）、引物组合Ⅲ（DPV TK、GPVVP1-VP2和GPMV NP）和引物组合Ⅳ（GPV VP3、DPV phosphoprotein和GPMV L）,多重PCR扩增标记Cy3制备探针与芯片杂交;并以GPV NS探针和引物组合Ⅰ扩增的混合探针比较基因芯片与琼脂糖凝胶电泳的灵敏度。试验结果显示:DPV-GPV-GPMV检测基因芯片与GPV GZ2、DPV SC和MDPV的VP3、VP1-VP2有杂交信号,而与MDPV的NS探针、鸭肝炎病毒、鸭源沙门氏菌、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌无杂交信号;芯片系统检测灵敏度可达7.886 ng/L探针,高于琼脂糖凝胶电泳;应用该诊断基因芯片对20份人工感染病料进行检测发现,DPV检出率为100%（20/20）,GPV检出率为85%（17/20）,GPMV检出率为80%（16/20）。表明所制备的DPV-GPV-GPMV检测基因芯片具有特异性强、灵敏度高等特点,能从核酸杂交水平上对鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和鹅副粘病毒进行多基因鉴定和检测,可用于四种病原混合感染的诊断。