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目的： 舌癌是最常见的口腔恶性肿瘤，其发生率和死亡率居高不下，当前舌癌的治疗手段仍然是手术辅以放疗或化疗的综合治疗，平阳霉素（P YM）和/或顺铂（cDDP）为主的化疗在舌癌的综合治疗中起重要作用，但化疗耐药一直是舌癌成功治疗的瓶颈问题。为了探讨舌癌细胞化疗耐药机制,本课题组前期通过低浓度递增结合大剂量反复诱导舌癌 Tca8113细胞建立了舌癌多药耐药细胞系（Tca8113/PYM），本研究拟利用该耐药模型，在差异蛋白质组学方法建立耐药差异蛋白质谱的基础上筛选鉴定新的耐药分子,为阐释舌癌耐药机制提供进一步证据。 方法： （1）采用蛋白质双向电泳（2-DE）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和 ESI-Q-TOF-MS串联质谱分析构建舌癌化疗耐药相关蛋白表达谱； （2）采用脂质体转染方法导入 Hsp27基因或靶向 Hsp27的 shRNA，采用western blot分别检测各组细胞 Hsp27的蛋白表达水平；ELISA方法检测细胞培养液中 Hsp27蛋白含量；分别用人 Hsp27重组蛋白（rhHsp27）和Hsp27中和抗体处理敏感细胞和耐药细胞后；M TS法检测各组细胞对PYM和cDDP的化疗敏感性； （3）将 Hsp27过表达细胞 Tca8113/pLEX-Hsp27和其对照细胞 Tca8113/p LEX-con细胞建立裸鼠移植瘤模型，体内观察 Hsp27过表达对舌癌细胞化疗敏感性的影响； （4）分别用western blot和ELISA检测在化疗条件下各舌癌细胞系中和细胞培养液中 Hsp27的蛋白水平，ELISA检测正常健康人和有/无经过 P YM和/或cDDP化疗舌癌患者血清中Hsp27的蛋白水平； （5）通过NF-κB活性的报告基因实验和western blot检测Hsp27表达干预、rhHsp27或 Hsp27中和抗体处理细胞中 NF-κB信号通路活性；通过转染sh-RN A干扰舌癌细胞 TLR5后，观察 rhHsp27对 NF-κB信号通路活性的影响，用免疫共沉淀实验观察细胞外Hsp27与TLR5的结合情况； （6）用Caspase3活性报告实验结合western blot检测Caspase3剪切情况以观察Caspase3活化情况，用 western blot检测线粒体和细胞质中凋亡相关蛋白水平；用免疫共沉淀实验观察Hsp27与BAX、BAD及BIM等促凋亡蛋白的结合情况。 （7）收集具备完整临床资料的舌癌标本，通过免疫组化法检测舌癌组织中Hsp27及其他相关基因的蛋白水平，分析 Hsp27蛋白水平与舌癌患者预后的相关性。 结果： （1）经过进一步诱导，目前舌癌耐药细胞Tca8113/P YM对P YM的耐药指数为15.37，对cDDP的耐药指数为6.82，并且呈现出明显的凋亡抗性； （2）差异蛋白质组方法发现18个舌癌耐药相关蛋白，其中表达上调蛋白12个，下调蛋白6个，部分差异蛋白验证结果与上述结果差异趋势一致； （3）耐药细胞 Tca8113/PYM中和其培养上清中 Hsp27蛋白水平明显高于正常口腔粘膜细胞 Hacat和 Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27等化疗相对较敏感的舌癌细胞，化疗药物能上调舌癌细胞和细胞培养液中Hsp27蛋白水平，舌癌患者血清中 Hsp27蛋白水平高于正常健康人血清，化疗能上调舌癌患者血清中Hsp27蛋白水平； （4）过表达 Hsp27或用 rhHsp27处理能增加舌癌细胞对 PYM和 cDDP的耐受性，干扰沉默 Tca8113/PYM中 Hsp27表达或用 Hsp27中和抗体处理能逆转舌癌耐药细胞的化疗耐受性；裸鼠体内实验表明过表达 Hsp27能增加Tca8113细胞对PYM和cDDP的化疗耐受性； （5）Tca8113/PYM细胞中NF-κB信号活性高于其他舌癌细胞，而IκBα蛋白水平低于其他细胞，在 Tca8113/P YM细胞中，干扰 Hsp27表达或用 Hsp27中和抗体处理能下调 NF-κB信号活性、p65核移和 p-IκBα水平，上调IκBα水平；在 Tca8113和SCC-25细胞中，过表达Hsp27或用 rhHsp27处理能上调NF-κB信号活性、p65核移位和p-IκBα水平，下调IκBα水平；在舌癌组织中 Hsp27高表达与 p65核移位呈正相关、与 IκBα蛋白水平呈负相关；通过转染 IκBα显性负突变载体 pBabe-IκBα或用 NF-κB抑制剂BAY11-7082抑制剂处理能逆转 rhHsp27处理诱导的 NF-κB信号活性升高； （6）舌癌细胞和组织中呈现较高的 TLR5表达丰度，在 Tca8113/PYM细胞中，干扰TLR5表达能下调NF-κB信号活性、p65核移和p-IκBα水平，上调 IκBα水平；在 Tca8113和 SCC-25细胞中，干扰下调 TLR5表达能逆转 rhHsp27诱导的 NF-κB信号活性、p65核移和 p-IκBα水平升高， IκBα水平下调；免疫共沉淀结果显示细胞外rhHsp27能与TLR5相互作用。 （7）干扰下调 Hsp27表达和过表达 Hsp27对舌癌细胞化疗敏感性和 Caspase3活化的影响强于 Hsp27中和抗体和 rhHsp27处理；Hsp27表达干预并不能明显影响化疗诱导BAX、BAD和 BIM表达；但在Tca8113和SCC-25细胞中，过表达Hsp27能抑制化疗诱导的BAX和BIM向线粒体移位、以及线粒体 Cytochrome C向细胞质的释放；在 Tca8113/P YM细胞中，干扰Hsp27表达则能促进化疗诱导的 BAX和 BIM向线粒体移位、以及线粒体Cytochrome C向细胞质的释放；免疫共沉淀结果显示 Hsp27能与 BAX和BIM结合。 （8）化疗能诱导舌癌组织促凋亡分子 BAX、BAD和 BIM表达，舌癌组织中Hsp27高表达与 p65核移位呈正相关，而与 IκBα蛋白水平和 Caspase3活化呈负相关；Hsp27高表达与舌癌患者预后呈负相关。 结论： （1）构建了舌癌耐药相关蛋白表达谱； （2） PYM/CDDP化疗能诱导舌癌细胞和舌癌患者血清中 Hsp27表达上调， Hsp27作为舌癌耐药的相关因子，能介导舌癌PYM/CDDP化疗耐药； （3）Hsp27在细胞外通过与 TLR5相互作用而下调 IκBα功能，从而活化舌癌细胞中NF-κB信号以介导化疗耐药； （4）Hsp27在细胞内通过与促凋亡分子 BAX和 BIM结合抑制其向线粒体移位，从而抑制化疗诱导的线粒体凋亡信号通路； （5）Hsp27在舌癌组织中高表达，Hsp27表达与舌癌患者预后呈负相关。