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目的:
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，同时它也是女性癌症中死亡的主要的原因，且其发病的机制相对复杂，研究揭示乳腺癌的发病可能与个人生活的习惯、生活的环境、生殖方面的因素和遗传方面的因素等多种因素及其相互作用有关。随着对长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的研究的不断深入，lncRNA相关的生物学方面的功能也逐渐浮现，且重心已出现向单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）方面转移的倾向。有研究表明，前列腺癌相关转录本1（PCAT1）是多种癌症的致癌因子且与癌症的进展密切相关，如前列腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等，但PCAT1与乳腺癌易感性之间的研究尚未被发现。本研究的目的是探究PCAT1的8个SNPs与乳腺癌易感性之间的关联，并对乳腺癌相关的SNP进行初步的功能探究。
方法:
1.生物信息学方法筛选PCAT1的SNPs并预测其潜在功能：
综合使用NCBI、Ensembl、1000Genomes和Haploview4.2根据最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）大于0.05筛选位于PCAT1上的SNPs，然后通过lncRNASNP2、DIANA、OncomiR和RNAfold预测SNPs对PCAT1二级结构的影响及可能与SNPs相结合的miRNA。
2.基因分型实验：
本研究采用的是依据年龄进行频数匹配的病例对照研究，并使用PASS软件进行样本量计算，最终纳入研究的样本量为病例组504例，对照组505例。本研究对PCAT1的位点rs1551513，rs1551514，rs17762938，rs7823297和rs9656964采用SNPscanTM多重SNP分型试剂盒进行分型；位点rs117117537和rs785003使用imLDRTM多重SNP分型试剂盒进行基因的分型；位点rs4473999采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction-restriction fragment-length polymorphism，PCR-RFLP）的分型方法进行基因的分型。
3.实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）：
本研究使用SYBR染料法进行qRT-PCR检测rs1551514和rs4473999位点的不同基因型血浆中PCAT1的相对表达量。
4.双荧光素酶报告基因实验：
本研究通过构建野生型和突变型的质粒载体，采用双荧光素酶报告基因实验验证PCAT1rs4473999基因型C/T对PCAT1与miR-149-5p的结合能力的影响。
5.与PCAT1rs4473999相结合的miRNA对乳腺癌细胞功能的影响：
本研究通过构建miR-149-5p的敲低和过表达的慢病毒载体并在MDA-MB-231和MCF-7细胞中筛选稳转株，采用CCK8实验、划痕实验和Transwell实验分别检测miR-149-5p的异常表达对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
6.统计分析方法：
本研究实验数据的统计分析所使用的软件主要包括SPSS22.0，SHEsis在线分析软件、MDR软件和ImageJ等。研究对象的基本信息的描述和分析采用两独立样本的t检验或χ2检验；LncRNA PCAT1遗传变异SNPs与乳腺癌易感性之间的关联性分析使用非条件的Logistic回归分析；拟合优度?χ2检验被用来计算各个SNP在对照组是否符合Hardy-Weinberg平衡；多个SNPs之间的联合作用使用在线软件SHEsis分析；基因（SNPs）与生殖因素之间的交互作用采用多因子降维法（MDR软件）分析；qRT-PCR结果先根据2-ΔCt计算目的基因的相对表达量，最后用独立样本的t检验对组间进行差异性检验；双荧光素酶报告基因实验使用独立样本的t检验分析不同组间萤火虫荧光与海肾荧光比值的差异；CCK8实验采用独立样本的t检验分析不同组间OD值的差异；细胞划痕实验采用ImageJ计算划痕的面积，并计算划痕愈合率，然后用t检验分析不同组间细胞划痕愈合率的差别；细胞Transwell实验采用ImageJ对染色细胞计数，然后用t检验分析不同组间侵袭细胞数目的差异。
结果:
1.PCAT1rs4473999基因型CT在超显性模型中与乳腺癌风险增加相关（OR:1.343,95%CI:1.000-1.803）。分层分析的结果表明，rs4473999突变基因型CT+TT相对于纯合野生型CC在绝经年龄≥50岁（OR:2.137,95%CI:1.065-4.286）和流产次数＜2（OR:1.510,95%CI:1.045-2.181）时均有较高的乳腺癌发病风险；rs785003突变基因型CT+TT相对于纯合野生型CC在无母乳喂养史时临界为乳腺癌的危险性因素（OR:2.764,95%CI:0.977-7.817），且其TT基因型与乳腺癌的HER-2激素受体状态存在关联（OR:0.158,95%CI:0.029-0.864）；rs117117537突变基因型GT+GG相对于纯合野生型TT在绝经年龄≥50岁（OR:2.413,95%CI:1.057-5.508）时有较高的乳腺癌发病风险；rs1551514的突变基因型GA+AA与Luminal型乳腺癌之间存在关联（OR:0.671,95%CI:0.452-0.997）。
2.PCAT1多个SNP联合作用的单倍型分析的结果提示单倍型Ars1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964Trs17762938Crs7823297Crs785003Trs117117537在病例组和对照组中所占的频率最高，分别为33.7%和34.5%；单倍型Grs1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964T5s17762938Crs7823297Trs785003Trs117117537可能增加乳腺癌的发病风险（OR:1.614,95%CI:1.116-2.333）。
3.基因生殖因素交互作用结果表明PCAT1基因多态性rs4473999、怀孕次数和哺乳史之间存在交互作用，且携带rs4473999T基因型，怀孕次数≥2和有母乳喂养史的人群乳腺癌的发病风险是其对照组人群的2.487倍（OR:2.487,95%CI:1.929-3.206）。
4.qRT-PCR的结果表明，对于rs1551514PCAT1在基因型GG中的相对表达量高于GA（P=0.033）和AA（P=0.021）基因型；对于rs4473999PCAT1在基因型CC中的相对表达量高于CT（P=0.001）和TT（P=0.038）基因型。
5.双荧光素酶实验的结果显示，rs4473999携带野生型基因C时PCAT1与miR-149-5p之间存在相互作用，但当rs4473999携带突变型基因T时尚未观察到PCAT1与miR-149-5p之间存在相互作用。
6.CCK8实验显示与阴性对照组（NC）相比较，miR-149-5p低表达组MDA-MB-231细胞在450nm时24h（P=0.002），48h（P=0.002），72h（P=0.002）和96h（P＜0.001）的OD值均较低；miR-149-5p高表达组MDA-MB-231细胞在450nm时24h（P=0.020），48h（P=0.016），72h（P=0.035）和96h（P=0.016）的OD值均较高。相似地，与NC组相比较，miR-149-5p低表达组MCF-7细胞在450nm时24h（P＜0.001），48h（P=0.016），72h（P＜0.001）和96h（P＜0.001）的OD值均较低；miR-149-5p高表达组MCF-7细胞在450nm时24h（P=0.013），48h（P=0.014），72h（P＜0.001）和96h（P=0.002）的OD值均较高。
7.细胞划痕实验显示与NC组相比较，miR-149-5p低表达组MDA-MB-231细胞愈合率较低（P=0.023），miR-149-5p高表达组MDA-MB-231细胞愈合率较高（P=0.043）；相似地，与NC组相比较，miR-149-5p低表达组MCF-7细胞愈合率较低（P=0.021），miR-149-5p高表达组MCF-7细胞愈合率较高（P=0.014）。
8.Transwell实验显示miR-149-5p低表达组MDA-MB-231的侵袭细胞数目低于NC组（P＜0.001），miR-149-5p高表达组MDA-MB-231的侵袭细胞数目高于NC组（P=0.014）。
结论:
1．PCAT1位点rs4473999CT基因型可能使乳腺癌的患病风险增加。位点rs785003纯合突变基因型TT可能与HER-2受体阳性性状相关；位点rs1551514的突变基因型GA+AA可能与Luminal型乳腺癌之间存在关联。
2．Grs1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964Trs17762938Crs7823297Trs785003Trs117117537单倍型可能增加乳腺癌的发病风险。PCAT1基因多态性rs4473999、怀孕次数和哺乳史之间存在交互作用，且可增加乳腺癌的患病风险。
3．PCAT1rs1551514位点G＞A突变可能使PCAT1的二级结构发生变化，且不同基因型中血浆PCAT1的相对表达量不同。
4．PCAT1rs4473999C/T突变可能影响PCAT1与miR-149-5p的结合能力且可能通过调控miR-149-5p的表达量影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，同时它也是女性癌症中死亡的主要的原因，且其发病的机制相对复杂，研究揭示乳腺癌的发病可能与个人生活的习惯、生活的环境、生殖方面的因素和遗传方面的因素等多种因素及其相互作用有关。随着对长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的研究的不断深入，lncRNA相关的生物学方面的功能也逐渐浮现，且重心已出现向单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）方面转移的倾向。有研究表明，前列腺癌相关转录本1（PCAT1）是多种癌症的致癌因子且与癌症的进展密切相关，如前列腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等，但PCAT1与乳腺癌易感性之间的研究尚未被发现。本研究的目的是探究PCAT1的8个SNPs与乳腺癌易感性之间的关联，并对乳腺癌相关的SNP进行初步的功能探究。
方法:
1.生物信息学方法筛选PCAT1的SNPs并预测其潜在功能：
综合使用NCBI、Ensembl、1000Genomes和Haploview4.2根据最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）大于0.05筛选位于PCAT1上的SNPs，然后通过lncRNASNP2、DIANA、OncomiR和RNAfold预测SNPs对PCAT1二级结构的影响及可能与SNPs相结合的miRNA。
2.基因分型实验：
本研究采用的是依据年龄进行频数匹配的病例对照研究，并使用PASS软件进行样本量计算，最终纳入研究的样本量为病例组504例，对照组505例。本研究对PCAT1的位点rs1551513，rs1551514，rs17762938，rs7823297和rs9656964采用SNPscanTM多重SNP分型试剂盒进行分型；位点rs117117537和rs785003使用imLDRTM多重SNP分型试剂盒进行基因的分型；位点rs4473999采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction-restriction fragment-length polymorphism，PCR-RFLP）的分型方法进行基因的分型。
3.实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）：
本研究使用SYBR染料法进行qRT-PCR检测rs1551514和rs4473999位点的不同基因型血浆中PCAT1的相对表达量。
4.双荧光素酶报告基因实验：
本研究通过构建野生型和突变型的质粒载体，采用双荧光素酶报告基因实验验证PCAT1rs4473999基因型C/T对PCAT1与miR-149-5p的结合能力的影响。
5.与PCAT1rs4473999相结合的miRNA对乳腺癌细胞功能的影响：
本研究通过构建miR-149-5p的敲低和过表达的慢病毒载体并在MDA-MB-231和MCF-7细胞中筛选稳转株，采用CCK8实验、划痕实验和Transwell实验分别检测miR-149-5p的异常表达对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
6.统计分析方法：
本研究实验数据的统计分析所使用的软件主要包括SPSS22.0，SHEsis在线分析软件、MDR软件和ImageJ等。研究对象的基本信息的描述和分析采用两独立样本的t检验或χ2检验；LncRNA PCAT1遗传变异SNPs与乳腺癌易感性之间的关联性分析使用非条件的Logistic回归分析；拟合优度?χ2检验被用来计算各个SNP在对照组是否符合Hardy-Weinberg平衡；多个SNPs之间的联合作用使用在线软件SHEsis分析；基因（SNPs）与生殖因素之间的交互作用采用多因子降维法（MDR软件）分析；qRT-PCR结果先根据2-ΔCt计算目的基因的相对表达量，最后用独立样本的t检验对组间进行差异性检验；双荧光素酶报告基因实验使用独立样本的t检验分析不同组间萤火虫荧光与海肾荧光比值的差异；CCK8实验采用独立样本的t检验分析不同组间OD值的差异；细胞划痕实验采用ImageJ计算划痕的面积，并计算划痕愈合率，然后用t检验分析不同组间细胞划痕愈合率的差别；细胞Transwell实验采用ImageJ对染色细胞计数，然后用t检验分析不同组间侵袭细胞数目的差异。
结果:
1.PCAT1rs4473999基因型CT在超显性模型中与乳腺癌风险增加相关（OR:1.343,95%CI:1.000-1.803）。分层分析的结果表明，rs4473999突变基因型CT+TT相对于纯合野生型CC在绝经年龄≥50岁（OR:2.137,95%CI:1.065-4.286）和流产次数＜2（OR:1.510,95%CI:1.045-2.181）时均有较高的乳腺癌发病风险；rs785003突变基因型CT+TT相对于纯合野生型CC在无母乳喂养史时临界为乳腺癌的危险性因素（OR:2.764,95%CI:0.977-7.817），且其TT基因型与乳腺癌的HER-2激素受体状态存在关联（OR:0.158,95%CI:0.029-0.864）；rs117117537突变基因型GT+GG相对于纯合野生型TT在绝经年龄≥50岁（OR:2.413,95%CI:1.057-5.508）时有较高的乳腺癌发病风险；rs1551514的突变基因型GA+AA与Luminal型乳腺癌之间存在关联（OR:0.671,95%CI:0.452-0.997）。
2.PCAT1多个SNP联合作用的单倍型分析的结果提示单倍型Ars1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964Trs17762938Crs7823297Crs785003Trs117117537在病例组和对照组中所占的频率最高，分别为33.7%和34.5%；单倍型Grs1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964T5s17762938Crs7823297Trs785003Trs117117537可能增加乳腺癌的发病风险（OR:1.614,95%CI:1.116-2.333）。
3.基因生殖因素交互作用结果表明PCAT1基因多态性rs4473999、怀孕次数和哺乳史之间存在交互作用，且携带rs4473999T基因型，怀孕次数≥2和有母乳喂养史的人群乳腺癌的发病风险是其对照组人群的2.487倍（OR:2.487,95%CI:1.929-3.206）。
4.qRT-PCR的结果表明，对于rs1551514PCAT1在基因型GG中的相对表达量高于GA（P=0.033）和AA（P=0.021）基因型；对于rs4473999PCAT1在基因型CC中的相对表达量高于CT（P=0.001）和TT（P=0.038）基因型。
5.双荧光素酶实验的结果显示，rs4473999携带野生型基因C时PCAT1与miR-149-5p之间存在相互作用，但当rs4473999携带突变型基因T时尚未观察到PCAT1与miR-149-5p之间存在相互作用。
6.CCK8实验显示与阴性对照组（NC）相比较，miR-149-5p低表达组MDA-MB-231细胞在450nm时24h（P=0.002），48h（P=0.002），72h（P=0.002）和96h（P＜0.001）的OD值均较低；miR-149-5p高表达组MDA-MB-231细胞在450nm时24h（P=0.020），48h（P=0.016），72h（P=0.035）和96h（P=0.016）的OD值均较高。相似地，与NC组相比较，miR-149-5p低表达组MCF-7细胞在450nm时24h（P＜0.001），48h（P=0.016），72h（P＜0.001）和96h（P＜0.001）的OD值均较低；miR-149-5p高表达组MCF-7细胞在450nm时24h（P=0.013），48h（P=0.014），72h（P＜0.001）和96h（P=0.002）的OD值均较高。
7.细胞划痕实验显示与NC组相比较，miR-149-5p低表达组MDA-MB-231细胞愈合率较低（P=0.023），miR-149-5p高表达组MDA-MB-231细胞愈合率较高（P=0.043）；相似地，与NC组相比较，miR-149-5p低表达组MCF-7细胞愈合率较低（P=0.021），miR-149-5p高表达组MCF-7细胞愈合率较高（P=0.014）。
8.Transwell实验显示miR-149-5p低表达组MDA-MB-231的侵袭细胞数目低于NC组（P＜0.001），miR-149-5p高表达组MDA-MB-231的侵袭细胞数目高于NC组（P=0.014）。
结论:
1．PCAT1位点rs4473999CT基因型可能使乳腺癌的患病风险增加。位点rs785003纯合突变基因型TT可能与HER-2受体阳性性状相关；位点rs1551514的突变基因型GA+AA可能与Luminal型乳腺癌之间存在关联。
2．Grs1551514Trs1551513Crs4473999Crs9656964Trs17762938Crs7823297Trs785003Trs117117537单倍型可能增加乳腺癌的发病风险。PCAT1基因多态性rs4473999、怀孕次数和哺乳史之间存在交互作用，且可增加乳腺癌的患病风险。
3．PCAT1rs1551514位点G＞A突变可能使PCAT1的二级结构发生变化，且不同基因型中血浆PCAT1的相对表达量不同。
4．PCAT1rs4473999C/T突变可能影响PCAT1与miR-149-5p的结合能力且可能通过调控miR-149-5p的表达量影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。