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Survivin(svv)基因是抗凋亡(inhibitors of apoptosis proteion,IAP)基因家族中最小的新成员,仅含有一个杆状病毒抗凋亡重复结构域(baculovirus IAP repeat,BIR)和C端有一个α螺旋的结构域。研究发现svv在癌组织或肿瘤组织中高表达。在诸多哺乳动物细胞中svv不仅具有抗凋亡的作用,而且在细胞分裂过程中也发挥着重要的作用。在家蚕(Bombyx mori)中也发现有svv(Bm-svv)类似基因的存在,位于第17条染色体,开放阅读框为411 bp,编码136个氨基酸。
为了解家蚕该基因的功能,本论文进行了如下的工作:
(1)从家蚕中克隆了Bm-svv基因,分别构建了表达载体pigA3-ie1-svv和杆状病毒表达载体Bm-Bacmid-ie1-svv及Ac-Bacmid-ie1-svv;建立了昆虫细胞诱导凋亡的模型,以H2O2分别诱导家蚕细胞(BmN)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf9细胞凋亡,采用CCK-8法检测细胞的活性,分析了H2O2的半效抑制浓度,即IC50;
(2)通过实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-QPCR)分析Bm-svv的转录水平,从两个方面来分析:一是用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染家蚕BmN细胞,分析发现,Bm-svv在感染2h的表达量最高,随时间的推移有所降低;二是用H2O2的IC50剂量刺激BmN细胞,结果发现Bm-svv和IAP也都在刺激2h的表达量最高,随时间的延长缓慢降低,并且两者表达的总体趋势相近。这些结果表明,Bm-svv基因不论是在细胞受到病毒感染还是凋亡刺激时,在早期阶段就有应激表达。
(3)将表达载体pigA3-ie1-svv和对照载体pigA3-ie1分别转染Sf9细胞,用G418筛选稳定化的细胞株。之后用H2O2的IC50剂量分别刺激稳定化转染细胞。结果表明,稳转pigA3-ie1-svv细胞的凋亡率明显低于对照组,具有显著性差异。由此说明,Bm-svv具有抗凋亡的作用。
(4)利用杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)研究Bm-svv基因的功能。将重组杆状病毒Bmie1-svv和Acie1-svv分别感染多种昆虫细胞。结果表明,由病毒Bmie1-svv介导表达的Bm-svv具有促进粉纹夜蛾(Trichoplusia ni) Tn5、灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis) Spli以及Sf9细胞增殖,由病毒Acie1-svv介导表达的Bm-svv能抑制BmN、Tn5细胞的凋亡以及减弱Spli细胞中凋亡小体的产生。表明由病毒介导表达的Bm-svv具有促进细胞增殖及抑制病毒自身引起的细胞凋亡等作用。
从上述的研究中得出以下结论:家蚕中存在促进细胞增殖的svv基因,该基因还有具有对抗H2O2刺激及病毒感染引起的细胞凋亡的作用;通常检测哺乳细胞活性的CCK-8法也可以应用于昆虫细胞的活性检测。