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β-1,4.半乳糖基转移酶(B4GTase)家族是一类在高尔基体上专一性负责合成β→1,4糖苷键,以对蛋白质,特别是膜蛋白进行糖链修饰的蛋白酶。此外,β4GTase还充当细胞膜的识别因子,参与精卵结合、细胞的生长与迁移、内分泌等过程及自体免疫性疾病调控等。本文就β4GTase的基因家族组成、蛋白质结构与功能、体内定位、测定方法及其生物学功能等研究进展进行了简述。 目前,对于大部分的β4GTase表达系统,由于受到各种因素的限制,仍无法获得大量的高效β4GTase蛋白,这给对β4GTase的进一步研究带来了很大困难。Gong等人建立了以E.coli DH5a菌株为宿主菌的小鼠β4GTase融合表达系统。本研究将对上述表达系统进行再优化,并对融合蛋白酶切、纯化,并对获得的重组目的蛋白进行酶活、催化特征等进行系列分析。 本实验首先抽提质粒pGEX-4T-2-β4GTase,而后将其转化进入另一E.coli菌株BL21(DE3)pLysS,因后者含有质粒pLysS,有助于降低宿主细胞原有蛋白的表达水平,从而提高融合蛋白的表达效率。对大量诱导培养的细胞进行裂解,离心,用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和柱对上清进行亲和纯化,获得融合蛋白;用凝血酶对纯化后的融合蛋白进行酶切,以Sephadex G-100柱分离酶切后的混合体系,获得重组目的蛋白β4GTase。最终产率为20mg蛋白/1L培养基。然后,利用pH依赖的苯酚红测定法绘制测定体系的光密度.H~+浓度标准曲线,配合重组蛋白催化反应的光密度.时间曲线,计算得知,重组蛋白的酶活为87.4 U,比活为21.85 U/mg。最后,对重组蛋白催化的一系列特征进行分析,确认重组蛋白的最适底物供体、受体分别为UDP-gal及GlcNAc,其最适pH为8.0,最适反应温度为30℃,最适金属辅基为Mn2~+,并发现反应产物UDP及其类似物UTP、α-乳蛋白均为重组蛋白强烈的抑制剂。