【摘 要】
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当今社会,肿瘤,艾滋,心血管疾病位列人类死亡前三大死因,癌症治疗缺乏有效手段,严重威胁人类健康,艾滋病HIV-1人类免疫缺陷病毒感染人体后,调控宿主细胞基因表达,造成免疫缺
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当今社会,肿瘤,艾滋,心血管疾病位列人类死亡前三大死因,癌症治疗缺乏有效手段,严重威胁人类健康,艾滋病HIV-1人类免疫缺陷病毒感染人体后,调控宿主细胞基因表达,造成免疫缺失,引发心血管受损,神经损伤等各种疾病。本文成功克隆292bp vpr编码蛋白,插入pcDNA3.1(+)质粒,构建真核表达载体,转染肿瘤细胞,检测周期及凋亡相关指标变化。本文成功构建cyclinD1启动子片段,cyclinE启动子片段,cyclinB1启动子片段插入PGL3-BASIC片段构建双荧光素酶报告基因载体,为检测病毒蛋白的周期作用机制提供实验依据。双荧光素酶报告基因实验证实tat转染宫颈癌细胞Hela,黑色素瘤细胞A375后上调P21启动子转录活性,而在结肠癌细胞HCT-116以及慢性髓性白血病细胞K562中不上调P21启动子活性,细胞种属间差异可能与细胞中P53状态有关。Tat转染hela细胞后,流式PI单染检测周期,证实G1/S阻滞,双荧光素酶报告基因检测证实cyclinD,cyclinE启动子活性下调,证实Tat从转录水平调控p21及周期蛋白表达。而Vpr则严格依赖P53调控P21转录活性,但其G2/M周期阻滞作用期阻滞及凋亡诱导作用与P53是否突变并非完全相关。pcDNA-Vpr转染hela细胞后,流式PI单染检测周期,证实G2/M周期阻滞,双荧光素酶报告基因检测证实cyclinD1,cyclinE启动子活性无显著性改变,cyclinB1启动子活性下调,realtime和western bloting检测证实mRNA和蛋白水平与启动子水平调控相符。热休克蛋白70家族与细胞内氧化损伤,应激作用有关,,双荧光素酶报告基因实验证实tat,vpr上调其家族成员hsp72.,hsp70b’启动子活性,,western blot发现vpr下调bcl-2蛋白表达,上调bax,活化caspase-3试剂盒分析表明上调caspase-3酶活,可能与其凋亡诱导机制相关。本文证实了病毒蛋白tat,vpr作为抗肿瘤活性分子的可行性,并构建hTERT端粒酶逆转录酶启动子近端转录起始位点至181bp-核心片段,插入PGL3-BASIC片段构建双荧光素酶报告基因载体,增加其靶向性作用。
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