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三角帆蚌是我国特有的优良淡水育珠蚌。颜色是评价珍珠质量的重要指标。供片贝贝壳珍珠层颜色(贝壳内壳色)显著影响珍珠颜色。本研究从珍珠或贝壳珍珠层呈色的直接因素(金属离子、有机物和珍珠层结构)着手,以实验室构建的紫色家系三角帆蚌(贝壳珍珠层颜色为紫色)和白色家系三角帆蚌(贝壳珍珠层颜色为白色)为实验材料,从紫色家系和白色家系三角帆蚌外套膜和珍珠囊比较转录组文库中筛选得到4个三角帆蚌贝壳珍珠层颜色形成相关基因。1.三角帆蚌Hc GIFLP基因的克隆与表达分析克隆得到三角帆蚌两个胃内因子样蛋白(gastric intrinsic factor-like protein,GIFLP)基因(Hc GIFLP1和Hc GIFLP2),并进行荧光定量、原位杂交及原核表达实验。Hc GIFLP1基因c DNA全长619bp,编码140个氨基酸;Hc GIFLP2基因c DNA全长821bp,编码148个氨基酸,Gen Bank登录号分别为KR822703和KR822704。Hc GIFLP1和Hc GIFLP2基因编码的多肽N端均含有一段由23个氨基酸组成的信号肽,无跨膜结构域,核苷酸序列和氨基酸序列相似度均较高。荧光定量结果显示,Hc GIFLP1基因主要在肝胰腺中表达,并且在紫色蚌中的表达量极显著高于白色蚌(P<0.01)。Hc GIFLP2基因主要在外套膜中表达,在紫色蚌后端缘膜中的表达量极显著高于白色蚌(P<0.01)。原位杂交结果显示,Hc GIFLP1和Hc GIFLP2基因在外套膜中的表达部位基本相同,杂交信号主要出现在外套膜缘膜的外上皮细胞,边缘膜中褶的外上皮细胞中也有一些信号。原核表达结果显示,两个基因的重组蛋白均主要以包涵体的形式存在。根据两个基因的氨基酸序列设计多肽制备多克隆抗体,并用原核表达纯化蛋白检测抗体的特异性,结果显示Hc GIFLP1蛋白的抗体特异性较好,只能检测到自身的重组蛋白,Hc GIFLP2蛋白的抗体未能检测到自身及Hc GIFLP1的重组蛋白。2.三角帆蚌Hc CUBDC基因的克隆与表达分析克隆得到三角帆蚌一个CUB结构域包含蛋白(CUB domain containing protein,CUBDC)基因Hc CUBDC,并进行荧光定量和原位杂交检测分析。Hc CUBDC基因c DNA全长5158 bp,编码639个氨基酸,Gen Bank登录号为KP067952。Hc CUBDC蛋白含有4个CUB结构域,属于CUB超家族,N端含有一段由19个氨基酸组成的信号肽,无跨膜结构域。荧光定量结果显示,Hc CUBDC基因在各个组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量最低。在紫色蚌中,后端缘膜表达量极显著高于前端缘膜(P<0.01);在白色蚌中,前端和后端缘膜之间表达差异不显著。Hc CUBDC基因在紫色蚌后端缘膜中表达量极显著高于白色蚌(P<0.01),在紫色和白色蚌前端缘膜中表达差异不显著。外套膜原位杂交结果显示,Hc CUBDC基因主要在外套膜缘膜外上皮细胞中表达。3.三角帆蚌Hc CA2基因的克隆与表达分析克隆得到了三角帆蚌一个碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因Hc CA2基因,并进行荧光定量和原位杂交检测分析。Hc CA2基因c DNA全长1770 bp,编码332个氨基酸,Gen Bank登录号为KR822705。Hc CA2蛋白含有1个CA结构域,属于α-CA超家族,N端含有一段由18个氨基酸组成的信号肽,无跨膜结构域。荧光定量PCR结果显示,Hc CA2基因主要在外套膜中表达,在其他组织中表达量很低。在紫色蚌中,后端缘膜表达量极显著高于前端缘膜(P<0.01);在白色蚌中,前端和后端缘膜之间表达差异不显著。Hc CA2基因在紫色蚌后端缘膜中的表达量极显著高于白色蚌(P<0.01),在紫色和白色蚌前端缘膜中的表达差异不显著。在珍珠形成过程中,插片后的前19天该基因表达量很低,19天之后表达量显著升高并维持在同一水平。贝壳修复过程中,该基因在对照组中表达不稳定,在前7个时间点处理组中的表达量均极显著低于对照组(P<0.01),在后7个时间点处理组几乎不表达。原位杂交结果显示,Hc CA2基因在外套膜内外上表皮细胞中均有表达。在外上表皮细胞中,杂交信号主要出现在缘膜部;在内上表皮细胞中,缘膜和边缘膜中均有信号,但缘膜信号比边缘膜较强。