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酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶，在体内胆固醇代谢平衡过程中起关键的调控作用。实验室已报道人ACAT1和ACAT2基因的组织结构，以及分别针对ACAT基因转录、剪接、RNA降解、蛋白翻译等多种表达调控机制。在实验室研究积累的基础上，论文工作着重对人ACAT表达的非编码RNA调控机制与相关活性化合物筛选系统的构建及应用进行了深入探索研究，主要有三部分工作。 1.人长非编码ACAT1C7基因组织结构、表达和功能 本部分工作首先进行人长非编码ACAT1C7基因组织结构与表达分析。序列分析显示ACAT1C7基因具有完整的RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)启动子结构，但无长的ORF。整个ACAT1C7基因定位于钾离子电压门通道家族KCND2基因的第一个内含子中，其转录方向与KCND2基因启动子的转录方向相反。RT-qPCR结果表明，ACAT1C7和KCND2基因在各种人细胞系中均有较低水平的表达，且在不同细胞系中的表达具有显著差异。通过一系列的缺失突变结合荧光素酶报告基因活性测定结果显示，ACAT1C7基因的启动子核心区约113bp，具有与SV40启动子可比的较强转录活性，并鉴定出其启动子核心区中存在反式作用因子CUTL1和Pbx-1a的顺式作用元件。进一步分析人长非编码ACAT1C7基因的组织结构，显示其P7启动子与下游外显子Xa交界处，存在-与P7启动子序列重叠、转录方向相反的Alu序列(revAlu)。通过序列同源性分析发现，人ACAT1C7基因中的revAlu属于进化上最年轻的AluY家族，在距今约560万年前出现。同时，发现Alu序列含有RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子，并且体外转录活性分析结果显示人ACAT1C7基因中的revAlu具有较强的PolⅢ启动子活性。此外，针对CpG位点的分析表明，该Alu中仅有15个CpG甲基化位点，表明该Alu的转座能力非常弱，其在基因组中的位置属于强固定型，而且这些CpG位点在单核类细胞中高度甲基化，并且实验结果显示该Alu中的CpG位点甲基化可显著抑制Alu的PolⅢ启动子活性，但对ACAT1C7基因的PolⅡ启动子活性无明显影响。进一步探索人长非编码ACAT1C7基因的功能，结果显示人长非编码ACAT1C7 RNA可与ACAT1mRNA发生跨染色体反式剪接并引起其连接的ACAT1mRNA发生从5’-到3’-端的快速降解，从而下调ACAT1蛋白表达。同时，遗传进化分析表明，完整的长非编码ACAT1C7基因仅在高等灵长类中存在。这部分工作为深入揭示人ACAT1C7基因的自身表达调控及跨染色体反式剪接功能机制等研究奠定非常重要的基础。 2.miR-9通过调控人ACAT1基因表达参与胆固醇代谢平衡调控 本部分工作首先通过软件预测人ACAT1 tuRNA3UTR中潜在的microRNAs结合位点，发现其中只存在一个miR-9结合位点，且该miR-9结合位点在各种属的ACAT1基因中高度保守。在人基因组中，成熟的miR-9有分别位于1号、5号和15号染色体的miR-9-1、miR-9-2和miR-9-3三种来源。进一步，为了检测人ACAT1基因及miR-9的表达是否具有相关性，我们用RT-qPCR分别检测TH-IP-1、SH-SY5Y、SK-N-SH、HEK293T、Caco-2、Huh7和HepG2等细胞中miR-9三种前体(pri-miR-9-1、pri-miR-9-2、pri-miR-9-3)，成熟miR-9及ACAT1基因的表达量。结果表明，人单核细胞(THP-1)和神经细胞(SH-SY5Y和SK-N-SH)中miR-9及其前体均特异性高表达，而其它细胞中较低表达，并且相关性分析显示miR-9与ACAT1基因的表达量统计学上存在显著负相关关系。然后，利用下游插入带有miR-9结合位点的ACAT1mRNA3’UTR的荧光素酶报告基因表达质粒，检测miR-9是否对ACAT1基因表达确有调控作用，结果显示在有miR-9表达时，检测到荧光素酶报告基因活性显著降低，并且荧光素酶报告基因活性降低的程度随表达质粒中所含miR-9结合位点的个数增加而提高。继而，利用外源转染包含ACAT1基因及其3’UTR的表达质粒，通过Western blot和RT-qPCR检测到miR-9抑制外源ACAT1蛋白翻译但并不促进其mRNA降解。进而，通过Western blot和RT-qPCR检测到miR-9可以降低细胞内源ACAT1基因的表达，同样证明了miR-9对于ACAT1基因表达的调控作用。最后，通过油红O染色法结合细胞内胆固醇/胆固醇酯的测定，发现miR-9可以抑制巨噬细胞/泡沫细胞中脂滴的堆积，降低细胞内胆固醇酯(ACAT1的酶促反应产物)的量。本部分工作研究miR-9结合人ACAT1 mRNA3UTR区域并抑制ACAT1蛋白翻译，通过下调ACAT1基因的表达以减少细胞中胆固醇酯的堆积，从而参与细胞内胆固醇代谢的平衡调控。这些有关miR-9对ACAT1基因表达调控机制的揭示，为深入探索ACAT1基因在胆固醇代谢平衡过程中的生理功能、病理变化等机理，提供重要基础。 3.针对人ACAT基因顺式元件的活性化合物筛选系统构建及应用 本部分工作首先分别构建人ACAT1基因P1启动子NFS顺式元件、人ACAT1C7基因P7启动子BAB顺式元件及人ACAT2基因启动子HNC顺式元件等多种人ACAT基因顺式元件控制的荧光素酶报告基因逆转录病毒包装质粒。进而，将成功构建的人ACAT基因顺式元件控制荧光素酶报告基因逆转录病毒包装质粒与辅助包装病毒粒子的表达质粒pCL10A1共同转染用于包装病毒的HEK293T细胞株，获得相应的逆转录病毒。进一步，利用病毒感染或质粒转染不同类型细胞，其中HEK293T、L02及SK-N-SH细胞株用逆转录病毒感染，Caco-2及SH-SY5Y细胞株用逆转录病毒包装质粒转染，并通过质粒中所带的真核抗生素筛选标记，筛选并鉴定获得人ACAT基因顺式元件控制下稳定表达荧光素酶报告基因的HEK293T、L02、SK-N-SH、Caco-2及SH-SY5Y等多种细胞株。进而，选取其中人ACAT1C7基因BAB顺式元件控制下稳定表达荧光素酶报告基因的HEK293T细胞株，利用实验室已有的约400种化合物，进行小规模化合物筛选，寻找对目标顺式元件有调控作用的活性化合物并为进一步的高通量活性化合物筛选优化条件。继而，选取三种不同顺式元件控制下稳定表达荧光素酶报告基因的细胞株，送至国家新药筛选中心进行高通量(48000种)活性化合物筛选，并进一步在实验室进行RT-qPCR检测鉴定，最终获得对人ACAT1基因/ACAT1C7基因表达有上调作用的9种活性化合物和对人ACAT2基因表达有下调作用的4种活性化合物。这部分工作，为ACAT基因功能及其相关药物研究等，提供有关理论依据和重要基础。 本论文的三部分工作表明，人ACAT1基因表达具有独特精细调控，提示其存在重要的生物学功能；利用ACAT基因启动子顺式元件系统，筛选获得相应的活性化合物。