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细菌适应热环境的机制研究一直以来都是微生物学家研究的热点,是研究细菌适应外界环境变化的机制及其进化的重要组成部分。然而前期的研究主要集中在热激反应阶段,对热激反应过后细菌如何维持热适应的研究还较少。为此,本论文充分利用功能蛋白质组学研究的技术和手段,对E.coli K-12维持热适应中起调节作用的胞浆蛋白及其相关蛋白质复合物进行研究,以期了解细菌维持热适应的调节蛋白及其蛋白调节网络,进而深入认识细菌适应热环境的机制。
本论文首先采用基于2-D native/SDS-PAGE的蛋白质组学方法对不同温度培养条件下的E.coli K-12胞浆蛋白进行了比较分析,鉴定了6个差异表达蛋白GroL、ClpB、DnaK、Mdh、MalE和LysU,并利用基因工程技术制备多克隆抗体,进而采用Western blotting技术验证这些蛋白的表达差异。
其次,通过2-D native/SDS-PAGE技术、质谱技术和对数据库的搜索,初步探索了6个热调节蛋白相关的蛋白质复合物,并利用His-pull down技术验证了其中部分复合物:GroL-Tig-RpsA,DnaK-AspS和GapA-AnsB的相互作用关系。然后,利用基因敲除菌及高表达菌株初步研究了6个热调节蛋白对E.coli K-12正常生长及高温下生长的影响。
最后,采用2-D native/SDS-PAGE技术对6个热调节蛋白对应的基因敲除菌在不同温度下的蛋白表达谱进行比较分析,以研究热调节蛋白相关的蛋白调节网络。利用质谱技术共鉴定出包括上述6个热调节蛋白在内的36个差异表达的蛋白。它们参与细菌能量代谢,信息处理等许多重要生理活动,是细菌热调节蛋白网络的组成部分。这些热调节蛋白不仅功能相关,在维持细菌热适应中发挥一定的作用,而且通过IntAct数据库查询,我们发现其中大部分蛋白在生理上还存在着相互作用关系。
这些发现不仅有助于我们清楚地了解细菌维持热适应中的热调节蛋白及其蛋白调节网络,进一步认识细菌适应热环境的机制,而且对细菌适应其他环境的研究也具有重要的参考价值。