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硫肽类抗生素是一类由微生物次级代谢产生的聚肽类天然产物。该家族化合物的化学结构十分复杂,富含不饱和氨基酸、噻唑或嗯唑等氮杂五元环以及一个以三或四取代的氮杂六元环为核心的大环结构。Thiostrepton(TSR,中文名硫链丝菌素)作为硫肽家族的典型代表,不仅具有很好的抗革兰氏阳性菌活性和抗疟疾活性,而且近年来人们还报道了它的抗癌活性。但这类抗生素的水溶性问题限制了它们在临床医疗上的进一步使用,所以我们希望从克隆TSR的生物合成基因簇出发,对其进行生物合成机制的研究,发展更具临床应用价值的新一代硫肽类抗生素。
我们首先以黏粒pJTU2554为载体,构建了TSR产生菌S.laurentii的基因组文库。根据与噻唑生物合成相关的环化脱水酶保守序列设计简并性引物,以S.laurentii的总DNA为模板,通过PCR扩增克隆了环化脱水酶的基因片段。在S.laurentii体内中断失活该基因,突变株不再产生TSR,证明了该环化脱水酶与TSR生物合成相关。我们接着以该片段为探针,对基因组文库进行筛选。经过Southern杂交实验和限制性酶谱分析,共获得六个相互重叠的重组黏粒。对其中的黏粒10E3进行测序并分析其序列,该黏粒共包含27个完整的开放读码阅读框(orf)。通过两侧基因的失活实验确定了完整的TSR生物合成基因簇,共包含21个基因,TSR的前体肽基因tsrH也位于其中。TsrH的碳端氨基酸序列与TSR大环骨架的氨基酸序列完全一致,证明了TSR经由核糖体途径生物合成产生,而不是此前学术界普遍认为的NRPS途径。基于基因簇中各个基因功能的生物信息学分析,我们提出了TSR生物合成的大致途径。即先由核糖体依据前体肽基因合成前体肽,再由后修饰蛋白对前体肽进行包括噻唑单元合成、丝氨酸苏氨酸脱水、[4+2]环加成、喹萘啶酸单元结构的生物合成以及与大环骨架相连、C末端酰胺化等这一系列后修饰,形成最终的次级代谢产物。
依据功能的不同,TSR生物合成基因簇中的21个基因可分为:1、与TSR大环骨架生物合成相关;2、与TSR分子中的喹萘啶酸单元结构生物合成相关;3、与TSR分子的成熟后修饰相关这三类。我们对这三类的基因分别进行了一系列的同框缺失。同框缺失与TSR大环骨架生物合成相关以及与TSR分子中的喹萘啶酸单元结构生物合成相关的基因获得的突变株都不再产生TSR,这证明了这两类基因在TSR生物合成中的重要性。而同框缺失与TSR成熟后修饰相关的基因tsrB、tsrC获得的突变株△tsrB、△tsrC,分别产生了两个与TSR结构类似的化合物8、9。
TsrB是一个α/β水解酶,它在TSR生物合成中的具体功能并不清楚。我们分离纯化了△tsrB产生的化合物8,1D、2D NMR鉴定化合物8的结构与TSR极其类似,唯一的差别在于其C末端是甲酯结构(TSR是酰胺)。该结构的阐明提示了TsrB作为一个羧酸酯酶催化了TSR末端甲酯水解生成羧酸。体外生化实验进一步的证实了TsrB的这一功能。
分析表明TsrB催化水解反应的产物与化合物9是同一个化合物。我们大量发酵△tsrC并分离纯化了所产生的化合物9,NMR证实了化合物9的结构与TSR仅有的差别在于C末端为羧酸结构。这进一步证实了TsrB催化产生的产物将做为TsrC的底物,TsrC作为一个酰胺转移酶,催化C末端的羧酸基团转化成酰胺,完成TSR的生物合成。
总之,我们克隆了TSR的生物合成基因簇,基于基因簇各基因的功能分析提出了TSR大致的生物合成机制。并通过一系列的体内实验、中间体化合物结构鉴定、体外生化实验研究了基因的功能,阐明了TSR碳端生物合成的机制。