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全球每年因脑卒中死亡的人数在550万人，占所有疾病死亡人数的10％，成为继心脏病、恶性肿瘤之后第三大致死性疾病。我国每年死于脑卒中患者约150万。临床上缺血性脑卒中发病率为85％，出血性脑卒中发病率为15％。对于血栓形成引起的缺血性脑卒中，溶栓治疗是目前最为有效的临床治疗方法。由于容易引起脑出血，溶栓药物的应用受到限制。研制新一代低出血倾向药物，探索溶栓药物导致脑出血的原因，使用脑保护药物抑制脑出血，将为溶栓治疗的广泛应用提供条件。 过去的半个世纪以来，溶栓药物研制的发展方向为从无血栓专一性到血栓专一性，从高出血倾向到低出血倾向。作为最新一代代溶栓药物，尿激酶原变体M5(Lys300 to His)，分子量54 kDa，是高血栓专一性低出血倾向的分子。本文在我们前期研究的基础上，首次将M5用于缺血性脑卒中的治疗，对其溶栓效率、安全性与tPA和proUK作对比研究。实验采用大鼠血栓MCAO模型，通过手术将成熟24 h的白色血栓注射到大鼠脑中动脉，使用微量注射泵通过静脉注射溶解血栓，并使用激光多普勒脑血流计实时监测大鼠溶栓治疗时的脑血流。除单独用药以外，尝试在缺血急性期将溶栓治疗与肝素抗凝治疗联合应用。实验结果表明，单独使用M5、reteplase和proUK都能够降低大鼠死亡率，接受高剂量M5治疗大鼠脑梗死体积也更小，神经功能恢复更好。高剂量M5治疗大鼠脑血流恢复的水平高于高剂量reteplase和高剂量proUK治疗，表明高剂量M5的双链酶活性更高。为了检测M5的单链酶活性，我们测定了溶栓治疗后大鼠尾部出血时间，结果表明M5治疗组大鼠尾部出血时间显著低于proUK治疗组。同时M5治疗组大鼠BBB通透性、脑血体积也小于reteplase和proUK治疗组，而溶栓结束后血液中纤维蛋白原含量M5治疗组最高。与reteplase和proUK单独用药相比，M5溶栓治疗大鼠脑卒中，脑损伤和出血倾向更低，具有更大的安全性。 M5高安全性的原因可能在于内源酶活性低，血液中MMP-9的活化弱，BBB通透性小。所以，单独使用M5，大鼠死亡率、脑梗死体积、BBB通透性、出血时间比reteplase和proUK更低，神经功能恢复更好，脑出血更少。联合使用M5和肝素、低分子量肝素与单独使用M5相比用药剂量可以降低1/3。与reteplase、proUK和肝素、低分子量肝素联合使用相比，M5与肝素、低分子量肝素联合使用溶栓效率最高，脑出血副作用最小。肝素与M5联合应用，增大了血液中MMP-9的活化，从而增大BBB损伤。降低M5剂量至单独用药1/3水平，在不影响rCBF的恢复的前提下，可以使血液中MMP-9的活化和BBB损伤减弱到接近单独用药水平，BBB损伤低于低剂量reteplase和proUK与肝素联合应用后。通过病理学诊断，我们发现溶栓治疗时大鼠脑出血的部位主要发生在丘脑、下丘脑、乳头体，大脑皮层部位的出血极少见到。 作为美国FDA唯一批准用于脑卒中治疗的药物，tPA具有引起脑出血的倾向，但这种作用具有严格的时间依赖性，临床研究发现脑缺血3h内注射tPA是安全的。为了研究tPA脑出血倾向的时间依赖性，我们在MCAO大鼠脑缺血的-15 min、15 min、90 min和120 min分别脑室注射tPA，发现在脑缺血15 min以内脑室注射tPA有很好的脑保护作用。使用plasminogen酶切reteplase，亲和层析制备并纯化得到Kringle2多肽和P多肽。将alteplase、kringle2、P、reteplase等一些列缺失变体，在脑缺血后15 min注射到MCAO大鼠侧脑室，我们发现Kringle2结构域介导了tPA的脑保护作用;tPA的脑保护作用与丝氨酸蛋白酶水解活性无关，P多肽会加大MCAO大鼠脑损伤。tPA能够调节脑缺血后BBB的开放模式，脑缺血后立即脑室注射tPA，引起了缺血3 h BBB开放和MMP-9活性的增加，但是缺血24 h BBB的开放和MMP-9的活性下降到PBS对照组水平。tPA的BBB调节作用可能是通过对内源tPA的调节作用实现的，我们将外源reteplase注入大鼠侧脑室，发现大鼠内源tPA的活性在脑缺血后24 h，显著下降。大鼠MCAO15 min脑室注射tPA，缺血24 h后免疫组化结果显示，MMP-9主要集中于神经元细胞内和血管壁中，神经元细胞外分布很少。除了血管调节作用以外，tPA对OGD PC12细胞也有很好的保护作用。ATP合酶的免疫组化结果显示，大鼠缺血侧大脑组织呈强阳性，而对侧未缺血脑区呈阴性。tPA脑保护作用使大鼠大脑组织ATP合酶的免疫组化阳性减弱。总之，tPA脑保护作用的机理包括神经元保护作用和BBB调节作用。 脑卒中溶栓治疗形成的血液再灌注会产生自由基，导致脑组织的损伤。类姜黄素是一种有效的抗自由基药物，能够降低脑卒中溶栓治疗过程中的脑损伤。类姜黄素包含姜黄素、去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素三种成分，我们使用硅胶柱分离纯化这三种成分。探讨类姜黄素中不同成分对大鼠血脑屏障通透性及脑水肿的影响。为了增加姜黄素、去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素的水溶性，提高生物利用率，我们将它们分别溶于氯仿，通过低压蒸馏制备水包油脂肪乳溶液。我们采用四种脑缺血模型，在体、离体水平上，全面评价它们的药理学活性。动物模型包括局灶性脑缺血和全脑缺血两种缺血方式。局灶性脑缺血模型为大鼠MCAO模型，采用静脉给药(溶于脂肪乳)和腹腔给药(溶于DMSO)两种给药方式。全脑缺血采用小鼠断头张口呼吸模型，静脉给药;沙土鼠全脑缺血模型，采用静脉给药。离体模型为PC12细胞氧和葡萄糖剥夺模型(Oxygen and GlucoseDeprivation，OGD)模型。结果表明静脉注射姜黄素、去二甲氧基姜黄素降低MCAO大鼠的死亡率、脑梗死体积、脑水含量及神经学评分，但去甲氧基姜黄素却提高MCAO大鼠的死亡率，没表现出神经保护作用。这一结果与采用静脉给药沙土鼠全脑缺血模型所得的结果一致。但采用腹腔注射时，姜黄素、去二甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素对MCAO大鼠都具有脑保护作用。去甲氧基姜黄素在不同给药途径条件下对MCAO大鼠具有不同的脑保护作用，原因是它们对MMP-9活化具有不同的抑制作用。姜黄素、去二甲氧基姜黄素在腹腔给药和静脉给药时可降低MMP-9 mRNA的表达和脑中MMP-9蛋白的活性，进而降低脑BBB通透性和脑水肿。但去甲氧基姜黄素药理学作用作用受到不同给药途径的影响，只有在腹腔给药时才有降低BBB通透性和脑水肿的作用。小鼠断头张口呼吸模型中，只有姜黄素会增大张口呼吸时间，表明姜黄素对全脑缺血的保护作用更强。姜黄素、去二甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素都会降低OGD PC12细胞凋亡。因此，我们认为对于脑卒中的保护作用，姜黄素药理学活性最强，其次为去二甲氧基姜黄素，而甲氧基姜黄素药理学作用会受到给药途径的限制。