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前言支气管哮喘（BA）是最常见的呼吸道疾病，是由多种因素共同参与的气道慢性炎症，临床表现为支气管壁平滑肌收缩使气道发生可逆性痉挛和狭窄，严重病例可导致呼吸衰竭和心功能不全，病死率约为1％。BA所引起的心脏损害已经引起人们的广泛注意。Iskandar研究发现成人BA持续状态可出现心肌缺血性损害，甚至诱发心功能障碍；Wickelgren证实平喘药可减轻心肌炎症；Lovis等进一步研究发现严重哮喘病人血浆中肌酸激酶、肌酸激酶同功酶、肌红蛋白水平升高。因此，BA可能造成心肌损害，但机制尚需进一步研究探索。目前已有研究表明，钙超载是心肌损害的主要发病机制之一，钙超载可激活胞内信号传导系统，其中以引起calpain的变化尤其重要。Calpain是一类钙离子依赖的半胱氨酸蛋白激酶家族，包括两种同工型结构μ-calpain（calpainⅠ）和m-calpain（calpainⅡ）。Calpain在静息状态的细胞中以酶原形式（80kDa+30kDa）存在，当细胞发生暂时的或局部的钙积累时，切去大亚基Ⅰ区N-末端和大部分小亚基的Ⅴ区自溶，经剪切后的形态（76kDa+18kDa）具有催化活性。Calpain被激活后，通过蛋白酶的水解作用而参与包括细胞骨架重构、信号传递、细胞周期的调整、细胞凋亡等生理和病理过程。本实验研究在建立豚鼠哮喘动物模型的条件下，应用免疫组织化学染色技术检测方法，观察在哮喘后豚鼠心肌组织中calpain表达的变化情况，并同时观察激素治疗对calpain表达的影响，对比观察光镜下心肌病理改变与心肌组织calpain表达变化的关系，探讨calpain表达在哮喘后心肌损害中的作用机制，为临床使用calpain抑制剂进行疾病治疗和预防提供新的理论依据。材料和方法1、动物模型制作及分组将单只豚鼠置于半封闭的容器中，于第1、4、7d分别超声雾化吸人1％卵蛋白3min使其致敏。然后将同等条件豚鼠随机分为三组进行研究，每组10只。①哮喘组：第21d超声雾化吸人2％卵蛋白5min诱喘，诱喘成功后24h取材；②激素治疗组：诱喘前7d开始每只豚鼠面罩吸入普米克令舒（每日两次，0.25 mg／次）至诱喘当天，诱喘成功后24h取材。③正常对照组：用生理盐水替代卵蛋白及糖皮质激素吸入（方法同上）。2、动物标本取材取材前，以1％戊巴比妥腹腔注射麻醉，将豚鼠仰卧位固定，以无菌器械解剖，整体取出心脏，将心脏沿房室交界切成两段，取心室段。留取的心肌组织标本，用4％多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片。3、实验方法及结果观察（1）切片常规HE染色，光镜观察三组心肌组织标本病理学改变。（2）免疫组织化学染色，在400倍镜下随机选取5个视野，成像后利用Motic Images Advanced 3.1图像分析系统对其染色强度进行分析，结果用灰度值表示，用以观察三组心肌组织calpainⅠ、calpainⅡ的表达强度。4、统计学处理图像分析检测数据以平均数±标准差（（?）±SD）表示。统计学处理用SPSS统计软件进行单因素方差分析与显著性检验，检验水准p=0.05。结果1、所有实验组豚鼠于于第21d开始每天一次超声雾化吸人2％卵蛋白5min诱喘，均出现明显哮喘症状与体征，并且肺组织病理学也证实哮喘动物模型制作成功。2、正常组与激素治疗组心肌纤维排列整齐，横纹清楚。哮喘组可见散在灶状心肌纤维崩解，节段性嗜伊红染色增强，心肌纤维横纹不清，偶见收缩带状坏死及灶状炎细胞浸润。3、CalpainⅠ在各组豚鼠心肌中表达的相对含量没有显著差异；4、哮喘组豚鼠心肌calpainⅡ表达含量较正常组明显增高；5、治疗组豚鼠心肌calpainⅡ表达含量较正常组没有显著差异。讨论豚鼠哮喘许多特点与人类相似，包括过敏反应由IgE介导，激发后可发生速发相与迟发相反应等。在本实验哮喘组豚鼠均出现明显哮喘症状与体征，肺部病理学也发现存在支气管平滑肌收缩，管腔狭窄，中性粒细胞等炎细胞浸润等，均证明哮喘动物模型制作成功。说明本实验动物模型可靠，重复性好，为下一步研究哮喘引起心肌损害的工作打下了良好的基础。BA是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症反应，严重时，可产生缺氧和二氧化碳潴留，致使呼吸性酸中毒和代谢性酸中毒，进一步出现循环衰竭。BA所引起的心脏损害已经引起人们的广泛注意，本实验哮喘组心肌HE染色证实了BA除肺部病变外，还存在心肌损伤的病理学改变。BA引起心肌损害的机理目前尚不十分清楚。动物实验和临床观察表明缺氧造成的一种细胞死亡形式——凋亡，在心肌损伤中有非常关键性的作用。氧自由基产生、钙超载、ATP、ADP、AMP含量耗竭、酸中毒、NO生成等与凋亡密切相关，其中钙超载与钙依赖的中性蛋白酶calpain激活是调亡发生机制中的重要环节。本实验结果发现，在豚鼠哮喘模型建立后，哮喘组豚鼠心肌calpainⅡ表达的含量较正常组和激素治疗组明显增高，而三组豚鼠心肌calpainⅠ表达的含量没有显著差异。提示哮喘发作导致的心肌缺血缺氧损害与calpainⅡ表达增加密切相关；与calpainⅠ表达没有关系（至少在哮喘持续发病24小时内没有见到）。BA引起的心肌缺氧过程早期可出现细胞内酸中毒，从而使Na+／H+交换增强，继而引起Na+／Ca2+交换增加，引起钙内流；缺氧还激活内质网上Ca2+-ATP酶，使细胞内储存的钙释放，引起细胞内Ca2+超载。Calpain的两种同工型结构calpainⅠ和calpainⅡ的激活所需要钙离子的浓度不同，分别为5～50μmol／L和200～1000βmol／L。活化的calpain进一步引起细胞损伤，它可以水解多种重要的底物蛋白，导致心肌细胞结构、功能和活力的丧失。杨永健等通过结扎大鼠左冠状动脉制作心肌梗死模型，术前7天使用雷米普利（ACEI）治疗，观察发现：左室游离壁calpainⅡ蛋白表达于心肌梗死第2天时达高峰，室间隔calpainⅠ蛋白表达在心肌梗死14天时增加，ACEI抑制calpainⅠ、calpainⅡ的上调，减少心肌梗死面积和间质纤维化，提示calpainⅡ参与缺血心肌组织的早期损伤过程，calpainⅠ参与梗死心肌组织的晚期重塑，与本实验结果相符。综上所述，calpain在病理状态下的活性增高，可能是一个理想的治疗靶点，因此研究和开发选择性更强、效果更显著、副作用更小的calpain抑制剂以作为临床上哮喘心肌损害的预防与治疗就将有十分重要的意义。结论1、卵蛋白诱发的支气管哮喘豚鼠存在心肌损伤；2、支气管哮喘豚鼠心肌calpainⅡ表达增加，与心肌损伤密切相关；calpainⅠ表达没有变化（哮喘持续发病24小时内）；3、吸入糖皮质激素能下调calpainⅡ的表达。